探討白血病患者骨髓中VEGF、bFGF、sICAM－1及CD105的表達對髓血屏障調節機制的影響

馬傳香，高昆山，劉樹剛，李 騫，王樹慶

（濰坊醫學院附屬醫院，山東 濰坊261031）

大多數急性白血病和慢性粒細胞性白血病外周血中的白細胞增高，而部分急性白血病外周血白細胞不增高，甚至減少。髓血屏障（marrow blood barrier，MBB）作為骨髓中成熟血細胞、外周血中的造血干細胞以及其它物質出入骨髓所必須經過的通路，是白血病細胞由骨髓入血的屏障，白血病時其調節機制究竟發生了那些變化？相關文章報道較少。二十年來，大量研究證實，血管新生在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉移過程中起著重要作用。血管新生受多種特異性調控因子的影響，包括血管內皮生長因子（vascular endotheliai cell growth factor。VEGF），堿性成纖維細胞生長因子（bovine basic fibroblast growth factor，bFGF），腫瘤生長因子等［1］。Thomas等［2］認為，粘附分子在正常造血調節中起重要作用，造血祖細胞、細胞基質與內皮細胞之間的相互作用決定了造血細胞是否從骨髓微環境中釋放。為此，本課題通過檢測 VEGF、bFGF、sICAM－1及CD105在白血病的表達情況，探討白血病時血管新生調控因子對髓血屏障調節機制的影響。

1 對象與方法

1.1 對象 本院初診未治白血病患者61例，男38例，女23例，中位年齡41（12－85）歲。急性淋巴細胞白血病（ALL）14例（T－ALL3例，B－ALL11例），急性髓系白血病（AML）35例（M12例，M212例，M36例，M43例，M512例）和慢性粒細胞白血病（CML）8例；慢性淋巴細胞白血病（CLL）4例；其中，外周血白細胞＞100×109／L為高白細胞白血病組（52例），＜100×109／L低白細胞白血病組（9例，其中T－ALL2例，M21例，M34例 ，M52例，）；所有病例符合MICM診斷標準。正常對照組20例，為查體健康者，男16例，女4例，中位年齡32.5歲。

1.2 抗凝骨髓液及骨髓涂片制備 取骨髓液2 ml，一份注入含5%EDTA干粉管抗凝，標本在30 min內2000r／min，分離10min，吸取上層液，置－80℃凍存。一份滴至多聚賴氨酸處理的玻片上，制備新鮮涂片2張，并及時用4%多聚甲醛／0.MPBS（pH7.2－7.6），含 1／1000DEPC（抑 制 RNA 酶 對mRNA的分解）的固定液固定30分鐘，蒸餾水充分洗滌，干燥后－20℃保存。

1.3 方法 （1）CD105原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，用于檢測骨髓涂片標本的CD105的mRNA序列，針對人的CD105靶基因的 mRNA 序 列 為 ①5’－TTCT CATGC TGGAA GCCAG CCAGG ACATG GGCCG－3’；② 5’－CATCG ACGCC AACCA CAACA TGCAG ATCTG GACCA－3’；③5’－TCCAG ACAAA GTGTG CCGAC GACGC CATGA CCCGA－3’；嚴格按照試劑盒說明書進行操作，結果判定陽性細胞胞漿著色為棕黃色顆粒狀，在光學顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞。計算陽性細胞百分率。（2）VEGF、bFGF、sICAM－1酶聯免疫吸附測定（enzyme linked－lmmunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，嚴格按試劑盒說明書進行操作。用自動酶標分析儀讀取吸光度（A）值，根據ELISA實驗所得的標準品的A值，相應濃度，應用Curve Expert 1.3軟件繪制標準曲線，分別求得骨髓液 VEGF，bFGF，sICAM－1濃度。

1.4 統計學分析 所有數據處理采用SPSS 11.5統計軟件處理。實驗數據均以均數±標準差（±S）表示，采用t檢驗，直線相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD105在不同類型白血病的表達 CD105在白血病的表達以急性髓系白血病（AML－M5）最高，急性髓系白血病（AML）AML－M3表達最低。AML－M5的陽性表達率為［（52.32±15.34）%］明顯高于正常對照組 ［（2.32±0.87）%］（P＜0.05）；AML－M3的陽性表達率為 ［（3.56±1.21）%］與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；CLL陽性表達率與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；其他白血病（T－ALL、B－ALL、M1、M2、M4、CML）的陽性表達率均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；CD105在高白細胞白血病組的表達明顯高于在低白細胞白血病組的表達（P＜0.05）；結果見表1；部分白血病陽性結果如圖1－6示。

圖1－6 分別為T－ALL、B－ALL、AML－M3、AML－M5、CML、CLL

表1 不同白血病分組CD105的表達

2.2 不同類型白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sI－CAM－1含量 骨髓液VEGF、sICAM含量在CML表達最高，bFGF在 B－ALL表達最高，VEGF、sICAM而含量在T－ALL明顯高于與正常對照組（P＜0.05）；bFGF含量在 T－ALL與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；CLL表達 VEGF、bFGF與正常對照組差異無統計學意義（P＞0.05）；CLL表達sICAM明顯高于正常對照組；其他白血病（BALL、M1、M2、M3、M4、M5、CML）VEGF、bFGF、sICAM均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；VEGF、sICAM在高白細胞白血病組的表達明顯高于在低白細胞白血病組的表達（P＜0.05）；而bFGF在高白細胞白血病組與低白細胞白血病組的表達無明顯差異（P＞0.05）。結果見表2。

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表達情況（±S，ng／L）

表2 不同白血病骨髓液 VEGF、bFGF、sICAM－1的表達情況（±S，ng／L）

注：與正常對照比較：P＜0.05，＊P＞0.05；高、低白細胞組比較：#P＜0.05，##P＞0.05。

VEGF bFGF sICAM－1 T細胞型 3 185.63±38.12＊ 8.50±5.41 175.51±76.52組別 例數＊20 111.23±73.28 7.33±3.21 159.62±48.89 B細胞型 11 460.20±143.35 32.35±17.65 497.56±154.12 M1 2 283.54±58.32 16.57±7.58 458.62±195.34 M2 12 321.33±78.66 18.42±9.87 386.79±154.37 M3 6 356.74±113.50 26.10±13.46 285.69±132.62 M4 3 376.57±83.64 21.67±12.65 426.87±186.70 M5 12 485.36±143.21 22.73±11.79 563.45±198.61 CML 8 528.35±137.67 28.56±18.46 587.62±147.29 CLL 4 122.32±61.65＊ 9.54±6.15＊ 487.69±167.54高白細胞組 52 398.77±127.18# 19.46±13.67## 532.37±176.93#低白細胞組 9 216.73±62.47 20.36±7.83 228.56±98.92正常對照組

2.3 CD105與 VEGF、bFGF、sICAM 的表達的相關性分析 骨髓液CD105在AML－3的表達與VEGF、bFGF、sICAM的表達呈負相關。在其他類型白血病與VEGF、bFGF、sICAM 的表達呈正相關。

3 討論

MBB的功能單位是髓竇，它是由連續的內皮層，間斷的基膜層和外膜層構成，髓竇聯絡成網，埋在纖維母細胞基質內。髓竇之間是造血組織，髓竇的內皮層是由一層連續排列的內皮細胞構成竇腔。基膜是由內皮細胞外基質構成。外膜層是由廣泛間斷地覆蓋在內皮層外面的外膜細胞構成，屬纖維母細胞。其覆蓋程度稱外膜細胞覆蓋率（ACCR）。ACCR參考值為60～65%［4］。關于血細胞出髓的機制十分復雜，既與MBB的結構特點有關，也和造血微環境的生化變化及各種造血調控因子的作用密切相關。

研究證實血管新生在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉移過程中起著重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）是一種血管內皮細胞特異的分裂原，能特異地刺激內皮細胞的分裂與增殖，促進血管的生長。bFGF是成纖維細胞生長因子（FGF）超家族成員，為重要的血管生成因子，它可以刺激內皮細胞的增生和遷移，從而促進腫瘤血管生成［4］；Dias［5］等證實白血病分泌的bFGF可引起內皮細胞釋放VEGF，VEGF與bFGF有協同作用。國外大量實驗均證實，CD105在新生的內皮細胞上強表達，是內皮細胞增殖的標志之一［6］。在白血病的發生過程中，粘附分子的數量和親和力的變化起重要作用，粘附分子的相互作用促進了白血病細胞的增殖。同時粘附分子可以改變白血病細胞的生物學行為，導致其浸潤和擴散的發生［2］。

本研究結果顯示骨髓液CD105、VEGF、bFGF、sICAM 在B－ALL、M1、M2、M4、M5、CML均存在較高表達，臨床上大多數白血病骨髓中高增殖的白血病細胞與外周血白血病細胞往往呈現正相關。Nagaoka T［7］使用透射電鏡在各種白血病時，其外周血中的白細胞增高則除與骨髓腔內無限增殖的白血病細胞所導致的髓腔壓力增高，使隔膜孔擴大易于突破髓血屏障等之外，還與外膜細胞覆蓋率明顯減低有關。原因可能為腫瘤血管生成的調節是一個復雜的網絡，是這些細胞因子相互作用，影響了髓血屏障的結構及調節機制，CD105與VEGF高表達刺激內皮細胞分裂和增殖，bFGF高表達刺激纖維母細胞的生長，刺激內皮細胞增生和遷移，兩者的表達量的平衡影響髓血屏障內皮層內皮細胞與外膜層纖維母細胞數量的平衡，影響著髓血屏障外膜覆蓋率，影響著出髓細胞的數量。所以，外周血中白細胞數增高機制除與白血病細胞無限增殖、白血病性干細胞的髓外增殖有關外，還與髓血屏障的嚴重受累有重要關系。

在 AML－3，CD105與 VEGF、bFGF、sICAM 的表達成負相關，CD105呈低表達，VEGF、bFGF、sICAM呈較高表達，臨床常常表現為骨髓增生極度活躍而外周血表現全血細胞減少，可能為髓血屏障內皮層內皮細胞與外膜層纖維母細胞數量的平衡未被完全打破所致。

在B－ALL CD105、VEGF、bFGF、sICAM 的表達水平均位于高值，而在T－ALL CD105、VEGF的表達較正常增高，而bFGF得表達與正常無明顯差別，而臨床上T－ALL往往表現高白細胞血癥和縱膈及其他組織的腫塊，可能與CD105、VEGF增高，bFGF正常表達，致使血管生成在髓血屏障的調節平衡被打破，觸發白血病細胞生長、浸潤和轉移。B－ALL臨床往往表現骨髓液流動性差、粘稠而不易抽取，推測原因可能為CD105、VEGF、bFGF、sICAM平行性增高，使血管生成與抗血管生成的平衡未被完全破壞，相對高增殖的白血病細胞，未有足夠的血管供應造成。在CLL CD105、VEGF、bFGF的表達與正常對照無明顯差別，而sICAM表達較高，臨床上骨髓CLL白血病細胞與外周血白血病細胞往往呈現一致性，可能為成熟淋巴細胞分泌CD105、VEGF、bFGF的量少有關。而sICAM的升高，競爭性的結合細胞表面受體，因而使細胞間粘附減少，使骨髓的白血病細胞釋放到外周血的細胞數量升高。

bFGF在高白血病組與低白血病組的表達量無明顯差異，推測原因可能為，bFGF在不同白血病的分泌量比CD105與VEGF、sICAM的分泌量低有關。但通過bFGF在 AML－M3、T－ALL、CLL的表達情況看，bFGF對髓血屏障有著較為重要的作用，與調節白血病細胞出髓有重要的關系。

總之，研究表明不同白血病患者存在不同程度的血管新生因子的異常表達，CD105、VEGF、bFGF、sICAM參與構成了骨髓內的誘導微環境，影響造血細胞的粘附、增殖和分化，影響髓血屏障的結構和調節機制，使髓血屏障調節平衡被打破，觸發白血病細胞生長、浸潤和轉移，在調節造血系統的生長、分化及細胞出髓、入髓中起重要作用。

［1］Kerbel R，Folkman J.Clinical translation of angiogenesis inhibitors［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（10）：727.

［2］Thomas X，Anglaret B.Cell adhesion molecules：expression and function in acute myeloid leukemia［J］.Bull Cancer，1999，86：265.

［3］Ferrara N，Kerbel RS.Angiogenesis as a therapeutic target［J］.Nature，2005，438（7070）：967.

［4］張志宏，楊崇禮.血液病造血組織病理學圖譜［M］.湖南：湖南科學技術出版社，1988：2－3.

［5］Dias S，Choy M，Alitalo K，et al.Vascular endothelial growth factor（VEGF）－C signaling through FLT－4（VEGFR－3）mediates leukemic cell proliferation。survival.and resistance to chemotherapy［J］.Blood，2002，99（6）：2179.

［6］Wikstrom P，Lissbrant LF，Statin P，et al.Endoglin（CD105）is expressed on immature blood vessels and is mare for surrival in prostate cancer［J］.Prostate，2002，51（5）：268.

［7］藍豐碩 綜述，林果為 審校.髓血屏障及其調節［J］.國外醫學·輸血及血液學分冊，1993，16（1）：11.