LTR對J亞群禽白血病病毒感染的影響

馮少珍，李 嬌，吳曉嬋，曹偉勝，廖 明

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

J亞群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV－J）屬于禽α反轉錄病毒屬。Payne等在1991年首次在肉雞中發現 ALV－J［1］，我國在1999年證實 ALV－J的存在［2－3］，2002年，首次發現蛋雞存在J亞群禽白血病［4－5］。但不到10年的時間，全國已有相當多的雞場發現該病，其主要臨床表現為骨髓瘤、血管瘤、淋巴瘤、纖維肉瘤等多種腫瘤［6］，造成雞群免疫抑制，并成為其他疾病的誘因。ALV－J可經種蛋垂直傳播和水平傳播，先天感染的子代雞發生免疫耐受，導致免疫抑制。

長末端重復序列（LTR）是反轉錄病毒基因組兩端的一段重復序列（5′LTR和3′LTR）。LTR與ALV的復制、轉錄、宿主范圍、組織細胞嗜性及致瘤譜系的改變有關［7－12］。為了探討LTR在骨髓瘤病變型ALV－J毒株NX0101產生免疫抑制中的作用，本試驗通過反向遺傳和搭橋PCR方法拯救重組病毒，將血管瘤病變型毒株HN06中兩端的LTR序列替換至NX0101毒株的相應位置，通過人工后天感染模型，研究ALV－J在試驗雞體內分布及造成機體和免疫器官損傷的狀況。

1 材料與方法

1.1 毒種和細胞 ALV－J骨髓瘤病變型NX0101克隆株由山東農業大學動物科技學院崔治中教授惠贈。ALV－J HN06株分離自發生血管瘤病變的病雞內臟，通過反向遺傳方法獲得HN06克隆株［13］。DF－1細胞和抗ALV－J gp85單克隆抗體JE9由揚州大學獸醫學院秦愛建教授惠贈。

1.2 重組質粒的構建 按照張紀元等報道的方法［14］，將 NX0101株前體基因組cDNA （GenBank登錄號DQ115805）克隆至載體pMDTM18－T中，獲得重組質粒pMDNX0101。根據NX0101株和HN06株前體基因組序列設計特異性引物（表1），通過搭橋PCR方法將HN06株前體基因組兩端的LTR序列（5′端1－325bp，3′端7309－7633bp）分別替換至NX0101株前體基因組的相應位置，獲得含有完整前體基因組結構的重組質粒pNX－HNLTR（圖1）。

表1 引物序列

圖1 重組質粒pNX－HNLTR構建

1.3 重組病毒NX－HNLTR株的拯救和鑒定 通過lipofectamineTM2000（Invitrogen公司），將重組質粒pNX－HNLTR轉染至 DF－1細胞中，37℃，5%CO2培養3d后收集細胞培養上清。經免疫間接熒光（IFA）方法檢測轉染細胞以及經 ALV抗原ELISA檢測試劑盒（IDEXX）檢測細胞培養上清均呈陽性反應者，收集細胞培養物上清作為連續傳代的接種物，并測定TCID50，病毒保存于－70℃。

按照賴漢漳報道的方法，利用抗ALV－J gp85單克隆抗體JE9對轉染細胞進行IFA檢測［13］，利用半定量方法對毒株進行定量，按照Reed－Muench氏法計算病毒的細胞半數感染劑量（TCID50）。

1.4 動物感染 7日齡SPF雛雞120只，隨機分為2個試驗組和1個對照組，每組40只，隔離飼養。試驗組分別通過人工腹腔接種104TCID50／0.2 mL的NX0101株和NX－HNLTR株，對照組不做任何免疫和攻毒。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 體重和胸腺、脾臟、腔上囊重量 每天觀察雞群生長狀態，各組在攻毒后不同時間點分別測量體重，解剖觀察病變，并取胸腺、腔上囊和脾臟稱重，計算免疫器官指數：免疫器官指數＝免疫器官重量（g）／雞活體重（g）×100%。

1.5.2 組織病原學檢測 采取雞胸腺、脾、腔上囊等組織，提取總基因組DNA。按照Smith等方法［13］進行PCR檢測病毒前體基因組整合水平。

1.6 統計分析 試驗數據采用SPSS 11.5軟件分析，并采用t檢驗法進行差異顯著性分析，P＜0.05作為檢驗標準。

2 結果

2.1 重組病毒的拯救 通過搭橋PCR構建重組質粒pNX－HNLTR，PCR產物電泳和測序結果顯示獲得序列正確的片段。PCR擴增片段經過雙酶切后連接至載體pMDNX0101中，測序顯示HN06株基因組兩端的LTR基因完整替換至NX0101株基因組的對應位置，獲得重組質粒pNX－HNLTR。

重組質粒pNX－HNLTR轉染 DF－1細胞，IFA檢測結果表明，大部分細胞的細胞質出現特異熒光（圖2），說明獲得了ALV－J病毒粒子，克隆化重組病毒命名為NX－HNLTR。含有重組病毒NX－HNLTR的細胞培養物傳8代，每1代細胞培養物上清均用ALV抗原ELISA檢測試劑盒檢驗，結果顯示，S／P比值均＞0.2，呈陽性，說明拯救的病毒粒子NX－HNLTR具有感染性。

圖2 重組質粒pNX－HNLTR轉染DF－1細胞3d后的IFA結果

2.2 ALV－J感染對體重及免疫指標的影響 如圖3所示，在試驗期1周開始，NX0101攻毒組的平均體重明顯低于正常對照組，差異顯著（P＜0.05）。NX－HNLTR攻毒組的平均體重在試驗期4周內與對照組的差異不大，但6周時平均體重（199.5g）明顯低于對照組（283g）（P＝0.043）。

圖3 ALV－J感染后雞只體重的變化

免疫器官指數分析結果顯示（圖4），攻毒組的胸腺、腔上囊和脾臟在攻毒后6周時萎縮最嚴重，免疫器官指數都顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗期6周內，NX0101攻毒組的胸腺指數和腔上囊指數都低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；脾臟指數波動較大，在2周時達到最高峰，隨后降低，6周時最小。NX－HNLTR攻毒組的脾臟指數在試驗期內均低于對照組，胸腺和腔上囊指數與對照組的相比，時高時低，規律不明顯。

圖4 7日齡雛雞感染ALV－J后免疫器官指數的動態變化

2.3 組織病原學檢測和LTR對病毒感染的影響

PCR方法檢測ALV－J在免疫器官分布的結果顯示，感染NX0101株的雞，骨髓和脾臟在攻毒后3周能檢測到病毒基因，胸腺和腔上囊則在6周才能檢測到；感染NX－HNLTR株的雞在攻毒后2周，脾臟可以檢測到病毒基因，骨髓和胸腺分別在3周和6周時才可檢測到（圖5）。

3 討論

本試驗將血管瘤病變型ALV－J毒株HN06中兩端LTR序列替換至骨髓瘤病變型ALV－J毒株NX0101的相應位置，得到重組毒株NX－HNLTR。7日齡SPF雞接種病毒NX0101和NX－HNLTR后，體重低于正常對照組，接種病毒HN06的雞也出現體重下降的現象［16］，說明 ALV－J對雞體生長有一定影響。接種了NX0101的雞，胸腺和腔上囊指數明顯低于正常對照組，胸腺和腔上囊的發育持續受到抑制。然而張利等［17］報道指出，接種了NX0101病毒（103TCID50）的雞在感染后2周時，體重和免疫器官指數增加，隨后在感染后5周內持續降低。結果有所差異，可能與攻毒量不同以及雞只個體有差異有關。

圖5 ALV－J在各感染雞免疫器官的分布

從各免疫器官中病毒基因的整合情況來看，NX0101攻毒組和NX－HNLTR攻毒組在攻毒后2周和3周開始發現病毒基因整合至脾臟和骨髓基因組，胸腺和腔上囊在攻毒后6周時可檢測到，而HN06攻毒組則在1周就檢測到病毒基因整合至骨髓和脾臟，胸腺和腔上囊在攻毒后4周可檢測到［16］。造血器官脾臟和骨髓是最先檢測到病毒基因整合的，胸腺和腔上囊在攻毒后期才檢測到病毒基因整合，也就是說病毒很可能最先感染的免疫器官是脾臟和骨髓，隨后是胸腺和腔上囊。病毒基因整合至各器官的先后次序反映出病毒在免疫器官中的感染過程。研究表明，LTR與ALV的宿主范圍和組織細胞嗜性有關［7－9］，LTR可能影響不同病變型ALV－J毒株感染不同組織的先后順序。

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