蛋雞肝細胞分離及制備方法的優化

周筱丹，董曉芳，佟建明，徐 鵬

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養學國家重點實驗室，北京 海淀100193）

肝臟是家禽脂類代謝的主要器官，因此蛋雞肝細胞的分離和培養對脂類代謝的研究具有重要意義。目前肉雞［1］的肝細胞培養方法已較為成熟。由于蛋雞的解剖結構與肉雞有明顯的差異，采用離體灌流法制備的肝細胞活率低［2］。因此離體灌流法還無法代替體內灌流法。本試驗通過對現有成年雞肝臟體內灌流方法［1］進行優化，為獲得更多高質量的肝臟細胞，提供更為合理的細胞分離和制備方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 用于原代肝細胞培養的蛋雞，購自北京延慶康莊雞場。選擇健康的25周齡海藍褐產蛋雞12只，分為2個處理，分別采用兩種肝細胞分離和制備方法，每個處理6個重復。

1.2 主要試劑 Williams′medium E細胞培養液、人胰島素、地塞米松、人轉鐵蛋白、青霉素、鏈霉素和抗壞血酸，均購自Sigma公司；新生牛血清為Invitrogen公司生產；臺盼藍、肝素鈉、戊巴比妥鈉等為國藥集團化學試劑有限公司生產；6孔細胞培養板為Corning公司生產。

1.3 蛋雞肝細胞的制備 于灌流前蛋雞禁食8h，翅靜脈注射4～5mL肝素鈉（1 400UI／mL）抗凝，腹腔注射5～10mL戊巴比妥鈉（50mg／mL體重）麻醉。待雞完全麻醉后，用38℃新潔爾滅溶液全身浸泡消毒，將消毒好的雞放入超凈臺，仰臥固定在手術臺上，從腹部中間起始，撥開腹部和胸部皮膚；沿胸骨兩側第一根肋骨剪斷，打開胸腔和腹腔，輕輕將腸道拉向軀體左側，結扎輸卵管靜脈和胰十二指腸靜脈后，在腸系膜后靜脈下穿2條棉線，結扎遠心端棉線，近心端棉線暫不結扎；在2條棉線之間用眼科剪將腸系膜后靜脈剪開小口，沿肝門靜脈方向插入小鼠灌胃針，并用近心端棉線結扎固定好小鼠灌胃針。以30mL／min的速度灌注37℃預熱的無菌灌流液 A （HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，EDTA二鈉鹽：5mmol／L；pH 值為7.4），待肝臟臌脹變為土黃色時剪開上腔靜脈，持續9min，隨后以30mL／min灌注37℃預熱的無菌灌流液B（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L；pH 值為7.4），持續10min；待流出的液體變清后，進行消化灌流，即以20mL／min灌注40℃預熱的無菌灌流液C（HEPES：10mmol／L，NaCl：137mmol／L，KCl：3 mmol／L，Na2HPO4·12H2O：3mmol／L，Ⅱ型膠原酶：0.4g／L和 CaCl2：5.4mmol／L；pH 值為7.4），15min后肝臟塌陷，消化完畢［1］。

1.4 原有的成年雞肝細胞培養灌流法［1］灌流前將蛋雞血管僅結扎腸系膜后靜脈遠心端，輸卵管靜脈和胰十二指腸靜脈不結扎。

1.5 肝細胞的分離 以肝臟先臌脹變土黃色隨后變塌陷松軟為肝臟灌流是否成功的標志。觸動肝臟表面松軟后，摘取消化好的肝臟，放入無菌平皿中，加入基礎培養液（Williams′medium E細胞培養液含10%新生牛血清），剔除血管、脂肪和結締組織，剪去肝臟周邊消化不完全的部分；用鑷子撕開肝臟包膜，肝細胞大量流出，用大口徑吸管輕輕吹打，隨后分別過100目、200目及400目細胞篩，所得肝細胞懸液用基礎培養液清洗，并500r／min離心5 min，棄上清后，沉淀用基礎培養液再清洗1次，離心（500r／min，5min）棄上清。用貼壁培養液重懸（Williams′medium E細胞培養液含10%新生牛血清、1μmol／L 人胰島素、1μmol／L 地塞米松、10 μg／mL人轉鐵蛋白、10μg／mL抗壞血酸和1%青霉素、鏈霉素）。

1.6 細胞計數和活率檢測 臺盼藍拒染法檢測細胞活力，吸取100μL細胞懸液與0.4%臺盼藍1∶1等體積混合均勻，用血細胞計數板計數。計算出制備出的肝細胞數量和活率。計算公式：

細胞活率（%）＝ 未染色的細胞數目／（未染色的細胞數目＋染色的細胞數目）×100%［19］。

1.7 蛋雞肝細胞的原代培養 細胞計數后，用貼壁培養液將細胞懸液稀釋為5×105個／mL，接種于6孔細胞培養板，每孔接種2mL細胞懸液，在37℃、5%CO2的培養箱內培養4h，細胞貼壁后換用無新生牛血清的 Williams′medium E。繼續培養，以后每24h更換一次培養液。

1.8 蛋雞肝細胞培養基上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的測定 細胞換液前，分別于4、24、48、144、168h收集6孔細胞培養液，以4℃12 000r／min，離心10min，取上清保存在－20℃冰箱，待測LDH活力。具體操作方法按照南京建成生物工程有限公司生產的LDH測定試劑盒說明書進行。將0.05 mL待測樣本與基質緩沖液1∶5混合，加0.05mL NADH 混勻，37℃水浴15min，加0.25mL 2，4－二硝基苯肼37℃水浴15min，加0.4mol／L NaOH溶液2.5mL，室溫放置3min，440nm蒸餾水調零1cm光徑測吸光度。

1.9 統計分析 采用SAS（8.02）軟件的 ANOVA程序進行方差分析，用Duncan′s法進行差異顯著性檢驗。試驗結果表示為“平均值±標準差”。

2 結果

2.1 不同方法下肝臟灌流成功率、肝細胞數量和細胞活率比較 采用本方法分離蛋雞肝臟細胞，6次試驗均灌流成功，肝臟灌流成功率達到100%，采用原有的成年雞肝細胞培養灌流法，6次試驗僅灌流成功2次，肝臟灌流成功率僅為33.3%。由表1可知，本方法培養的肝細胞通過細胞計數，計算出從每個肝臟獲得的肝細胞數量為（1.09±0.21）×109個，肝細胞數量是采用原有方法的122倍。經臺盼藍拒染法檢測細胞活率，本方法所獲得的肝細胞活率比采用原有方法提高了17.4%。

表1 不同方法下肝細胞數量和細胞活率比較

2.2 不同方法下肝細胞培養基上清液中LDH活力的測定 不同肝細胞培養灌流法分離的肝細胞培養基上清液中LDH的測定結果，見表2。由表2可知，本方法和原有方法制備的肝細胞，其培養基上清液中LDH活力在4、24、48、144h和168h無顯著差異（P＞0.05）。

表2 培養基上清液中的LDH的活力的測定 （U／L）

3 討論

3.1 不同方法下肝臟灌流成功率、肝細胞數量和細胞活率比較 原有的成年雞肝細胞制備方法多以肉雞和種公雞作為試驗動物［3］，采用結扎腸系膜后靜脈的兩步原位灌流法制備肝細胞，取得了良好的效果。但這一分離方法在蛋禽肝細胞的制備上并不適用，肝臟灌流成功率太低是其不適用的主要原因。與肉雞和種公雞不同，蛋禽具有發達的輸卵管靜脈叢，輸卵管靜脈與肝門靜脈相通，因此按原有的成年雞肝細胞培養灌流法會極易導致灌流液無法完全進入肝臟，肝臟不能與灌流液充分接觸導致灌流失敗。肝臟灌流是肝細胞分離技術最重要的環節，灌流的成功與否直接影響肝細胞制備的數量和存活率。通過兩種方法的對比試驗，可知本方法可以保證較高的成功率，肝細胞數量和活率也保證試驗的需求。

3.2 不同方法下肝細胞培養基上清液中LDH活力的測定 LDH存在于肝細胞內，當細胞膜破損時大量的LDH從細胞內泄露出來。細胞培養液中的LDH的活力，常是用來指示細胞的損傷程度，反應了細胞膜的完整性。環境中LDH的活力越低，表明細胞膜受損的程度越小［3］。本試驗結果與陳曉春等［2］的報道相一致。但與Jauregui等［4］報道小鼠肝臟細胞培養液上清中LDH活力為（9.2±1.5）×10－6IU不一致，這可能與試驗動物不同有關。

4 結語

通過對蛋雞肝細胞分離和制備方法進行優化，可使肝臟灌流成功率提高至100%，每只雞可獲（1.09±0.21）×109個肝臟細胞，肝細胞活率為（95.3±1.3）%；肝細胞形態和培養基上清液中的LDH活力與原方法無顯著差異。因此，本試驗方法與原有方法相比，更適用于產蛋家禽肝細胞的制備和培養，效果更佳。

［1］陳黎龍，江青艷，朱曉彤，等.成年雞肝細胞的分離與原代培養［J］.江西農業大學學報，2008，30（3）：385－389.

［2］陳曉春，陳代文，張克英，等.AICAR和二甲雙胍對產蛋雞肝細胞AMPK活性及脂質代謝的影響［J］.畜牧獸醫學報，2006，37（8）：769－773.

［3］Andradejr D R，Andrade D R，Santos S A.Study of Rat Hepatocytes in Primary Culture Submitted to Hypoxia and Reoxygenation：Action of the Cytoprotectors Prostaglandin E1，Superoxide Dismutase，Allopurinol and Verapamil［J］.Arquivos de Gastroenterologia，2009，46（4）：333－340.

［4］Jaurequi H O，Hayner N T，Driscoll J L，etal.Trypan Blue Dye Uptake and Lactate Dehydrogenase in Adult Rat Hepatocytes－Freshly Isolated Cells，Cell Suspensions，and Primary Monolayer Cultures［J］.In Vitro，1981，17（12）：1100－1110.