小鵝瘟病毒VP3基因的原核表達

趙文婧，魯 承，黃京愛，王暖成，樸相哲

（1.延邊大學農學院動物醫學系，吉林 延吉133000；2.吉林省延吉市畜牧防疫站，吉林 延吉133000；3.吉林省延吉市動物衛生檢疫站，吉林 延吉133000）

小鵝瘟是由小鵝瘟病毒（GPV）引起的主要侵害4～20日齡雛鵝的一種烈性傳染病，該病病程短，傳染性強，死亡率高，給養鵝業造成了嚴重的危害。是由我國學者方定一于1956年在江蘇揚州首次發現的［1］。經研究發現，VP3基因是小鵝瘟病毒核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80%，具有較高的保守性，能夠誘導機體產生中和抗體，是GPV主要保護性抗原［2］。本試驗旨在克隆與表達小鵝瘟VP3基因，為進一步研制單克隆抗體和基因工程疫苗奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與菌種 GPV 為本實驗室從延邊某養鵝場發生小鵝瘟的病死鵝脾臟中分離。大腸埃希菌DH5α、BL－21、pGEX－4T－1菌株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq，均購自寶生物工程（大連）有限公司，其他為國產分析純。

1.3 引物的設計與合成 根據GenBank發表的小鵝瘟病毒（GPV）B株全基因序列，針對VP3基因保守區，利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0軟件設計合成了1對引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，擴增片段長度為1 457bp，下劃線為BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點，序列如下：

1.4 DNA的提取 DNA的提取按文獻［3］方法進行。

1.5 PCR擴增 反應體系：ddH2O：12.3μL，10xPCR Buffer：2μL，dNTP：1μL，P1：1μL，P2：1μL，DNA：2.5μL，ExTaq：0.2μL。

反應程序：95℃預變性5min，94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸2min，進行35個循環，最后于72℃再延伸5min。

取5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，－20℃保存備用。

1.6 克隆質粒pMD－VP3的構建及鑒定 用DNA凝膠回收試劑盒進行純化回收VP3基因片段并將該片段與克隆載體pMD－18Tsimple連接，連接產物轉化至DH5α感受態細胞。挑取陽性克隆子接種于Amp／LB中，220r／min 37℃過夜，提取重組質粒后分別進行PCR及酶切鑒定。鑒定正確后送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.7 重組表達質粒的pGEX－VP3的構建及鑒定將鑒定正確的pMD－VP3經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，將目的片段亞克隆至pGEX－4T－1中，構建重組表達質粒的pGEX－VP3。并將該質粒轉化入BL21感受態細胞中，經PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序鑒定。

1.8 重組質粒的誘導表達 將已經鑒定為陽性的重組菌，用1mmol／L的IPTG進行誘導表達。分別在2、4、6、8h取樣，應用SDS－PAGE電泳對蛋白的表達情況進行檢測。

1.9 Western－blot分析 將表達的蛋白進行SDSPAGE后轉印至NC膜上，一抗為1∶200稀釋的小鵝瘟陽性兔血清，二抗為1∶2 000稀釋的HRP－羊抗兔IgG，進行 Western－blot分析。

1.10 包涵體的鑒定 按每克濕菌加入3mL PBS，反復凍融3次。采用超聲裂解法，裂解后的菌液4℃12 000r／min 5min。上清、沉淀分別進行SDSPAGE電泳，檢測重組蛋白存在形式。

2 結果

2.1 PCR擴增 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1 457bp處出現目的條帶，與預期片段大小相符（見圖1）。

2.2 克隆質粒的PCR鑒定 將提取的克隆質粒進行PCR鑒定，在1 457bp處有一清晰的條帶，與預期片段大小一致（見圖2）。

2.3 克隆質粒的酶切鑒定 克隆質粒經BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切得到兩條特異性基因片段，1條約為1 457bp，另1條約為2 700bp，所得結果與理論值相符（見圖3）。測序結果表明，克隆的目的片段與GenBank中的核苷酸序列同源性為96.8%，證明成功地克隆了小鵝瘟VP3基因。

2.4 重組質粒pGEX－VP3的PCR鑒定及酶切鑒定 用1.5%瓊脂糖凝膠分析PCR產物，結果擴增出一條1 457bp的目的條帶，將重組表達質粒經BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，得到了約4 900bp和1 457bp兩條條帶，得到的片段與預期片段相符（見圖4）。序列測定結果顯示，氨基酸序列與克隆序列結果一致。經DNAMAN分析及BLAST進行同源性比較，氨基酸的同源性為96%。

2.5 重組質粒的誘導表達 經12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，在81ku處有一條特異蛋白條帶，與預期的蛋白分子量大小一致。重組菌株37℃誘導表達8h的表達量最高（見圖5）。

2.6 Western－blot分析 表達產物轉至NC膜上后，與小鵝瘟陽性血清反應，在81ku處出現1條陽性反應帶。表明該蛋白為小鵝瘟特異性蛋白且具有很好的反應原性。

2.7 蛋白存在形式的鑒定 由圖6可見，重組蛋白大部分以包涵體的形式存在于沉淀中，上清液中較少。

圖6 重組菌裂解后上清與沉淀的SDS－PAGE電泳

3 討論

GPV屬于細小病毒科、細小病毒屬成員，核酸為單鏈、線性DNA，約為5 000bp，其中VP3基因全長1 605bp，編碼534個氨基酸。通過對基因組的結構分析表明具有高度的保守性，具有較好的免疫原性［4］。

本試驗采用的原核表達系統異源蛋白具有細菌生長快、菌體密度高、成本相對低廉、操作方法簡便等優點［5］。大腸桿菌的全部基因序列測定工作已完成，遺傳背景清楚，在多數科研工作中是蛋白表達的首選宿主［6－9］。本試驗為了提高外源基因表達的穩定性和產量，采用了融合表達蛋白載體pGEX－4T－1。載體的SD（Shine－Dalgarno）序列及核糖體結合位點（RBS）對基因的轉錄和翻譯效率有很大的影響，而pGEX質粒的多克隆位點位于GST基因之后，因此不會改變載體的SD序列及RBS。蛋白純化條件溫和，可以直接從細菌裂解液中用固定化谷胱甘肽將它吸附，無變性劑的加入，最大限度地保持了蛋白的天然構象，有利于保持蛋白活性。小鵝瘟VP3基因重組蛋白主要是以包涵體形式存在，重組蛋白以包涵體形式表達常可避免細胞內蛋白水解酶的作用，增加了產物的穩定性，有利于目的蛋白的富集和純化。

目前本病的防治主要靠疫苗免疫和卵黃抗體、抗血清，其中疫苗免疫主要以弱毒疫苗為主，但在生產實踐中效果不夠理想，因此，研制新型疫苗具有廣闊的發展前景。本研究成功表達了小鵝瘟病毒主要保護性抗原VP3基因，為進一步研制單克隆抗體和基因工程疫苗奠定一定基礎。

［1］方定一.小鵝瘟介紹［J］.中國畜牧獸醫雜志，1962，8：19－20.

［2］Richard E G.Diseases of poultry［M］.11st ed.Ames：Iowa State University Press，2003：367－374.

［3］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.3版.北京：科學出版社，2002.

［4］邢明偉，王君偉，賀云霞.鵝細小病毒NS2基因的克隆與序列分析［J］.中國預防獸醫學報，2003（3）：9.

［5］Kroos L，Maddock J R.Prokaryotic Development：Emerging Insights［J］.J Bacteriol，2003，185（4）：1128－1146.

［6］Wal lner M，Gruber P，Radauer C，etal.Lab scale and medium scale production of recombinant al lergens in Escherichia coli［J］.Methods，2004，32（3）：219－226.

［7］Balbas P.Understanding the art of producing protein and nonprotein molecules in Escherichia coli［J］.Mol Biotechnol，2001，19（3）：251－267.

［8］Olins P O，Lee S C.Recent advances in heterologous gene expression in Escherichia coli［J］.Curr Opin Biotechnol，1993，4（5）：520－525.

［9］Makrides S C.Strategies for achieving high－level expression of genes in Escherichia coli［J］.Microbiol Rev，1996，60（3）：512－538.