豬圓環病毒2型北京株的分離及基因組序列分析

吳惠明，鄭瑞峰，郭 峰，靳興軍，傅彩霞，陳立本，韓 磊，杜 鵑，王玉田，李 佳

（北京市獸醫實驗診斷所，北京 朝陽100101）

豬圓環病毒2型（PCV2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征，豬呼吸道綜合征，繁殖障礙，肉芽腫性腸炎，壞死性淋巴腺炎，滲出性皮炎，先天性震顫等疾病也證實與PCV2感染有關［1］。

近年來，對PCV2遺傳變異情況的報道不斷增多。PCV2b基因型已取代PCV2a成為當前的優勢基因型毒株［2］；PCV2基因組多為1 767nt或1 768 nt，而近年來有文獻相繼報道了基因組為1 766nt的新毒株［3－5］。為了了解當前北京地區感染豬群中PCV2的基因變異情況，為PCV2的分子流行病學、感染及預防控制提供參考，本研究對2010年北京地區的PCV2PCR檢測核酸陽性的病料進行PCV2分離鑒定，并與GenBank登錄的序列進行了同源性比較、構建了系統進化樹，確定了分離毒株的基因型。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞株 ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PCV1和PCV2PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；PCV陰性PK15細胞為農業部獸醫診斷中心惠贈；DMEM、新生牛血清，購自Hyclone公司；D－Glucosamine、辣根過氧化物酶葡萄球菌A蛋白標記物、AEC購自Sigma公司；特異性抗PCV2抗血清，購自VMRD公司。

1.2 病料及PCR檢測 病料采自2010年北京平谷等地規模化豬場具有PMWS臨床癥狀的病豬的淋巴結、肺臟和脾臟組織。病料按照PCV1和PCV2PCR檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.3 病毒的分離及鑒定 取PCR檢測為PCV1陰性且PCV2陽性的組織病料樣品，按1∶10（W／V）加入DMEM培養液，將組織研磨后，凍融3次、離心取上清液，過濾除菌。通過用D－氨基葡萄糖處理PK15細胞促進PCV2繁殖和分離［6］。用IPMA方法對分離的病毒進行鑒定，IPMA操作方法參照文獻［7］。

1.4 全基因組序列的測定與分析 參考文獻［5］合成兩條引物PCV2－F（5′－ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT－3′）和 PCV2（5′－GTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCA－3′），提取病毒培養物 DNA，擴增全基因組序列。擴增條件為預變性94℃5min；94℃30s，62℃1min，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。將PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。用DNAStar軟件包進行全基因組核苷酸同源性分析。用MEGA5進行PCV2ORF2序列比對，并使用Neighbor－Joining算法生成系統進化樹。最后，根據PCV2ORF2序列之間的遺傳距離假定閾值0.035為標準劃分基因型［8－10］。

2 結果

2.1 PCR檢測結果 采自北京平谷等地的2份病料樣品中均擴增出為1 154bp的目的條帶，表明PCV2檢測為陽性，PCV1陰性。

2.2 病毒分離鑒定結果 將經處理的兩份組織勻漿，同步接種到PK15細胞后72～120h，沒有出現細胞病變，盲傳4代。應用IPMA檢測F5代病毒時，可見接種的兩份分離毒株PK15細胞內出現特異性紅棕色沉淀，而空白對照細胞內無紅棕色沉淀，說明接種病毒的PK15細胞內有PCV2增殖，待檢病毒為PCV2。兩個毒株分別命名為BJ2010LC株和BJ2010PG株。圖1為BJ2010LC株IPMA試驗結果，圖2為BJ2010PG株IPMA試驗結果，圖3為IPMA試驗空白對照細胞。

圖1 BJ2010LC株IPMA試驗結果（200×）

2.3 全基因組序列分析 病毒培養物PCR擴增獲得1 800bp左右目的條帶。PCR產物測序顯示，分離的2株PCV2全基因組序列均為1 767bp，已錄入GenBank中，BJ2010LC株登錄號為JQ002671，BJ2010PG株登錄號為JQ002672。兩株病毒ORF2長度均為705bp。BJ2010PG株ORF2有兩個終止密碼子，編碼233個氨基酸；BJ2010LC株ORF2編碼234個氨基酸。序列同源性比較表明，本研究分離的2個PCV2分離株與10個PCV2株間的同源性為94.2%～99.5%。參與比較的毒株中，3個毒株分別為PCV2aPCV2bPCV2c的參考毒株，6株分別為2004年至2009年分離至北京的PCV2毒株。其中，BJ2010PG毒株與AF005394（PCV2b參考毒株）和BJ0401同源性較高，分別為99.5% 和 99.3%。BJ2010LC 毒株與 BDH 和BJ0901b同源性較高，均為99%。本次分離獲得的2個毒株之間的同源性為96.6%。

2.4 遺傳進化樹的構建和分離毒株基因分型 參考文獻［8－10］，利用 MEGA5的 Neighbor－Joining法將所分離2株PCV2的ORF2序列分別與PCV2a PCV2bPCV2c基因型參考毒株進行比對和系統進化分析，結果見圖4。由圖4可知，上述毒株分為四個基因型，分別為 PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。分離毒株BJ2010LC株屬于PCV2d基因型，BJ2010PG屬于PCV2b基因型。

圖4 PCV2ORF2基因序列構建的遺傳進化樹

3 討論

對于PCV2基因型的劃分和命名，不同的研究組織常使用不同的劃分標準和名稱［5，9，11］。針對這種情況，2008年歐盟PCVD聯合會（www.pcvd.eu）推薦通過遺傳進化分析的方法對PCV2進行基因型命名，將PCV2基因型命名為PCV2a、PCV2b、PCV2c，并且分別將GenBank中最早的報道的原型毒株AF055392和AF055394分別作為PCV2a和PCV2b參考株，將20世紀80年代只有在丹麥發現的PCV2EU148503作為PCV2c的參考株。該方法根據序列間遺傳距離（p－distance）不同進行分類，對PCV2ORF2序列進行比對，劃分不同PCV2基因型的遺傳距離假定閾值設為0.035［8］。Ge X 等［10］依據此方法對我國2001至2010年的68株PCV2進行了分析，結果顯示，這些毒株中無PCV2c，有PCV2a、PCV2b和PCV2d。其中PCV2d是依據該方法劃分出來的又一新基因型。PCV2d基因型毒株的特點是CAP基因終止密碼子發生突變，導致ORF2變為705nt［10］。

本研究分離得到兩株PCV2，其中BJ2010LC株屬于PCV2d基因型，BJ2010PG屬于PCV2b基因型。Ge X 等［10］指出，北京地區存在PCV2a、PCV2b、PCV2d三種基因型毒株。PCV2b已成為我國優勢基因型，而PCV2d在我國北京、河北、山東、江西等11個省市存在［10］。

ORF2是PCV2變異最大的一個開放閱讀框，有四種長度，分別為696bp、702bp、705bp和708bp，分別編碼231、233、234（或233）個氨基酸和235個氨基酸。ORF2基因是主要的結構蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，多數PCV2毒株的ORF2為702 bp［10，12］。BJ2010PG 和 BJ2010LC 株 ORF2 長 度 為705bp。BJ2010PG有兩個終止密碼子，編碼233個氨基酸；BJ2010LC株編碼234個氨基酸。而ORF2長度的不同對其功能的影響還有待進一步研究。

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