18SrRNA序列差異在馬梨形蟲分類學中的應用

羅 金，劉光遠，田占成，謝俊仁，沈 輝，田美媛

（中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室農業部草食動物疫病重點開放實驗室，甘肅 蘭州730046）

馬泰勒蟲（Theileriaequi）作為引起馬梨形蟲病重要的病原之一，對馬屬動物產業造成了很大的危害［1］。該病主要以發熱、貧血、淋巴結腫大為主要臨床癥狀，偶爾也有死亡案例的報道［2］。馬泰勒蟲的命名一直存在爭議，這給馬泰勒蟲病的臨床診斷和流行病學調查帶來了諸多不便。梨形蟲的鑒定與分類，主要分為傳統分類學和分子分類學［3］。傳統分類學依據病原形態、發病動物臨床癥狀等條件進行分類。但由于病原形態的局限，生活史較難追蹤，傳播媒介多樣性，種種弊端使傳統分類學存在一定的局限［4］。隨著分子技術的發展和高保守性基因的發現，分子分類學方法在物種的分類上應用越來越廣。

本文通過對中國肇源株馬梨形蟲18SrRNA V4高變區核苷酸序列進行PCR擴增并對陽性質粒測序。建立系統發生樹，分析進化關系，同源性分析馬巴貝斯蟲與泰勒蟲及巴貝斯蟲之間的親緣關系，并以18SrRNA核苷酸一級結構為基礎，揭示該基因在分類學上的本質。分析馬巴貝斯蟲的種屬性特異性，從而為馬巴貝斯蟲的分類提供進一步的依據。

1 材料與方法

1.1 蟲體及試驗動物 本試驗所用馬梨形蟲蟲株均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所蟲種資源保藏課題組提供。6～12月齡的馬匹，購自于無馬梨形蟲病報道的地區。試驗開始前馬匹被切除脾臟，并連續進行病原學檢查，在無任何血液原蟲感染時才能用于試驗。

1.2 蟲體基因組DNA提取及18SrRNA核苷酸V4高變區的擴增 液氮保存的含蟲血液分別接種試驗動物，當染蟲率達到5%以上，靜脈采血。取300μL蟲血，利用Gentra公司的DNA提取試劑盒，提取基因組。參考馬泰勒蟲（DQ287951）和駑巴貝斯蟲（FJ209026）18SrRNA基因序列進行比對分析后在其V4高變區設計特異性引物。Bc18SF 5′－GACTTAAACCCTCGCCAGA－3′，Bc18SR 5′－TATGGTTAGGACTACGACGGT－3′；Te18SF 5′－TTTGGGCTGTTTACAGTTGC－3′，Te18SR 5′－CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG－3′。PCR擴增體系為去離子水37.5μL，10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL，2.5 mmol／L dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，蟲體基因組DNA 1μL，rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL。退火溫度56℃下進行PCR。并將克隆到pMD19－T載體上的PCR產物送北京三博遠志生物科學技術有限公司進行測序。

1.3 序列比對和分析 測序所獲得的序列與Gen－Bank中登錄的不同梨形蟲的18SrRNA V4高變區（數據未顯示）進行分析。用DNAStar軟件包中MegAlin對序列進行分析。Clustal W方法對序列進行對齊，構建系統發生樹，并分析梨形蟲種內及種間親緣關系。通過泰勒蟲與巴貝斯蟲核苷酸序列一級結構特征，分析兩蟲種之間18SrRNA核苷酸序列的V4高變區的差異性。

2 結果

2.1 馬梨形蟲18SrRNA V4高變區擴增及序列分析 PCR產物所得到的馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲18S rRNA V4高變區序列長度分別為531bp和452bp。將該序列與GenBank中公布的部分梨形蟲18S rRNA核苷酸序列共同構建系統發生樹。顯示，泰勒蟲種和巴貝斯蟲種分屬兩大分支。在巴貝斯分支中，駑巴貝斯蟲種分為一支，犬巴貝斯蟲和分歧巴貝斯蟲構成一支，二聯巴貝斯蟲作為單獨一支存在。泰勒蟲分支中存在兩個主要的分支。羊泰勒蟲和環形泰勒蟲有著較近的親緣關系，與中華泰勒蟲處于同一分支。而我國肇源株馬泰勒蟲與馬巴貝斯蟲在同一分支如圖1。

圖1 基于18SrRNA基因的梨形蟲系統進化樹

2.2 同源性分析 Clustal W方法比對試驗中所測梨形蟲序列的同源性進行分析。結果顯示，馬泰勒蟲（肇源株）和羊泰勒蟲、中華泰勒蟲、環形泰勒蟲、馬巴貝斯蟲的同源性分別為91.8%、91.0%、91.0%、96.4%。在巴貝斯科中，其種內18SrRNA序列的同源性均高于93.0%，而駑巴貝斯（肇源株）蟲與犬巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲的同源性分別為93.3%、94.9%。

2.3 序列對齊分析 通過DNAStar軟件中的MegAlin對所研究的序列進行對齊。顯示梨形蟲18SrRNA基因序列具有很高的保守性，僅V4高變區存在較大差異。值得注意的是巴貝斯蟲與泰勒蟲在一些區域存在較長片段的缺失，或者某個基因的 缺失或變異見圖2。

圖2 馬泰勒蟲及泰勒蟲種和巴貝斯蟲種18SrRNA對齊分析。補充及序列差距用O表示，核苷酸置換相關性用□表示

3 討論

長期以來馬泰勒蟲的分類一直存在爭議。以往的文獻及教科書中都將其命名為馬巴貝斯蟲，認為馬泰勒蟲屬于巴貝斯科、巴貝斯屬。我國對馬泰勒蟲的分類研究主要建立于傳統分類方法（包括病原的形態、致病性、傳播媒介與傳播方式、生活史等）基礎上［5］。然而馬梨形蟲相似的形態結構，難以追蹤的生活史使得馬梨形蟲的鑒定存在較大困難。分子生物學技術的發展使人們能夠在分子水平上認識病原，18SrRNA基因已在物種分類領域得到廣泛應用［6］。18SrRNA作為梨形蟲最為保守的序列，在物種分類上具有重要意義。龔真莉（2010）［7］在我國首次利用ELISA方法對駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲進行了鑒別，交叉反應試驗特異性良好，從而區分了馬梨形蟲兩個蟲株的分類學特征。該方法雖能很好對馬梨形蟲分型，但對其正確命名沒有闡述。Grandi G等［8］，通過間接熒光抗體技術和巢式 PCR（nPCR）方法對意大利北部地區的馬梨形蟲病情況進行了調查。Georges K C等［9］以18SrRNA為靶基因，應用反向線性印跡方法對馬泰勒蟲病的診斷方法進行了評估。以上方法不同程度的說明了當地馬梨形蟲病的流行情況。但是都不能很好的對馬泰勒蟲進行分類鑒定。Raksha Bhoora［10］以馬泰勒蟲表面裂殖子抗原基因（EMA1）為模板設計特異性引物，利用實時定量PCR對馬泰勒蟲的基因型進行了分析，從而得出馬泰勒蟲存在3個基因型的結論，但是至于泰勒蟲的隸屬于泰勒蟲蟲種還是巴貝斯蟲種，作者并沒有給出答案。羅金 等（2011）［11］利用Hsp70對我國馬梨形蟲在世界馬屬動物梨形蟲中的分類學地位進行了闡述。從而為馬巴貝斯蟲隸屬于泰勒蟲種的泰勒蟲科分類命名給出了證據。同年，羅金［12］利用18SrRNA基因再次對馬泰勒蟲的分類學特征進行了研究，得出的結論與上述一致。

18SrRNA基因序列作為物種分類鑒定重要的靶標序列，已經得到廣大科研工作者的認可，但是其分類鑒定的本質是什么，還未曾報道。本試驗選擇馬梨形蟲18SrRNA基因序列的V4高變區設計引物，通過PCR技術獲得該序列片段，并構建了系統發育進化樹，同時對梨形蟲之間的親緣關系做了進一步的闡述，最終利用該序列的一級結構特征對泰勒蟲和巴貝斯蟲之間的分類進行了闡述，進一步佐證了馬巴貝斯蟲隸屬于泰勒蟲科，泰勒蟲屬。系統發生結果顯示，泰勒蟲和巴貝斯蟲分為明顯的兩支。在巴貝斯蟲的分支中，駑巴貝斯蟲（肇源株）與美國株及西班牙株有較高的同源性，分別為98.4%、98.2%。馬泰勒蟲（肇源株）與西班牙蟲株親緣關系較近，其同源性為96.4%，而與南非株和蘇丹株高達98.3%。值得注意的是之前被稱為馬巴貝斯蟲的蟲種和馬泰勒蟲種在同一分支上，同源性為96.4%。以上結果表明，18SrRNA這種高度的保守性，在物種的分類鑒定方面有著重要的應用價值。為進一步闡明18SrRNA在不同物種間的分類學本質。我們對不同梨形蟲18SrRNA核苷酸序列進行對齊分析，結果顯示，在其序列的V4高變區巴貝斯蟲相對泰勒蟲有部分片段的缺失，一些位點的突變也是造成泰勒蟲和巴貝斯蟲種間差異的主要原因。馬巴貝斯蟲18SrRNA核苷酸一級結構表明，其序列特征和泰勒蟲科、泰勒蟲屬序列特征基本一致，而與巴貝斯蟲存在較大差異。結合馬泰勒蟲和巴貝斯蟲病原形態、致病性、傳播方式等特點我們最終確定，馬巴貝斯蟲屬于泰勒蟲科，泰勒蟲屬。

［1］羅金，劉光遠，田占成，等.馬梨形蟲病診斷技術的研究現狀［J］.動物醫學進展，2011，32（1）：99－104.

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［12］羅金，劉光遠，田占成，等.基于18Sr RNA基因序列的我國馬梨形蟲分類學地位分析［J］.動物分類學報，2011，36（1）：99－103.