IBDV感染對(duì)SPF雞腔上囊與外周血單核細(xì)胞TLR3／4／15 mRNA表達(dá)的影響

郭新風(fēng)，王麗瓊，李煥榮，阮文科，崔德鳳，王 寧，劉鳳華

［北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京市獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，CAU－BUA TCVM教學(xué)與科研團(tuán)隊(duì)，北京 昌平102206］

宿主細(xì)胞的 Toll樣受體（Toll－like receptors，TLR）通過識(shí)別病原微生物保守的分子相關(guān)模式，誘導(dǎo)天然免疫信號(hào)而激活炎性細(xì)胞因子，上調(diào)共刺激因子而激活細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗病毒反應(yīng)［1］。TLR3能誘導(dǎo)干擾素Ⅰ型的釋放；TLR4可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；TLR15在病毒感染中有報(bào)道，可能在機(jī)體先天性免疫中發(fā)揮作用［2－3］。

雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）主要侵害腔上囊內(nèi)具有IgM的B淋巴細(xì)胞，引起嚴(yán)重而長(zhǎng)期的免疫抑制，導(dǎo)致免疫失敗，影響多種病毒疫苗的免疫應(yīng)答［4］。IBDV感染可啟動(dòng)機(jī)體先天性免疫，通過巨噬細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子抵抗病毒感染［5］；通過增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能啟動(dòng)獲得性免疫［6］。腔上囊單核細(xì)胞（BBMC）和外周血單核細(xì)胞（PBMC）作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其表面的模式識(shí)別受體在IBDV入侵中的識(shí)別作用及啟動(dòng)免疫反應(yīng)的機(jī)理少有報(bào)道。本試驗(yàn)使用相對(duì)熒光定量PCR技術(shù)，通過分析IBDV感染對(duì)SPF雞BBMC和PBMC在感染后不同階段TLR3／4／15mRNA表達(dá)的影響，探討IBDV感染對(duì)固有免疫反應(yīng)的影響，為進(jìn)一步研究IBDV發(fā)生過程中宿主與病原相互間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料

4周齡SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）BC6／86毒株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Trizol，購(gòu)自In－vitrogen（美國(guó)）公司；淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自TBD公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及攻毒 4周齡SPF雞30只，對(duì)照組和攻毒組各15只，再隨機(jī)分為3組，每組5只。點(diǎn)眼途徑感染IBDV BC6／85株標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒，50倍的囊最小感染量（BID）／只雞，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。

2.2 腔上囊和外周血單核細(xì)胞的制備 分別在感染后1、5、15d采集雞心臟EDTA抗凝血，按照雞淋巴細(xì)胞分離液說明書介紹的步驟進(jìn)行雞外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，配成1×106個(gè)／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存?zhèn)溆茫粺o(wú)菌取腔上囊，去除表面的脂肪組織、被膜等，2%犢牛血清的1640沖洗，刀背刮取腔上囊內(nèi)淋巴細(xì)胞于2%1640培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行150目篩和300目篩過濾離心，同PBMC步驟分離雞腔上囊單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，配成1×106個(gè)／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物的合成與RNA的反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Gen－Bank上各基因的序列，用Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)各自的特異PCR引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 β－actin、TLR3、TLR4與TLR15擴(kuò)增引物的序列和反應(yīng)條件

按照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄在20μL體系中進(jìn)行，1μL總RNA，DEPC水11 μL，Oligo（dT）0.5μL，70℃5min，M－MLV RT 5×Buffer 4μL，dNTP 2μL，MgCl21μL ，Ribo－nucelase Inhibitor 0.5μL，42℃ 60min，70℃15 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置－80℃冰箱備用。

2.4 SYBR GreenⅠ相對(duì)熒光定量RT－PCR檢測(cè)方法的建立 本試驗(yàn)選用β－actin作為參照基因［7］。將β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的陽(yáng)性cDNA進(jìn)行10系列稀釋成6個(gè)梯度作為模板，利用各自的特異性引物進(jìn)行real－time PCR建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。20μL PCR反應(yīng)體系：10μL SYBR Green Real－time PCR Mix，1μL Rox Buffer，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，模板1μL，加水至20μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化，系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增效率基本一致時(shí)方可采用相對(duì)熒光定量比較CT值［8］。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。使用2△△Ct法對(duì)感染后不同時(shí)間的toll樣受體分子進(jìn)行比對(duì)。

△△Ct＝（Ct目的基因－Ct看家基因）×試驗(yàn)組－（Ct目的基因－Ct看家基因）×對(duì)照組

2－△△Ct表示的是試驗(yàn)組目的基因表達(dá)對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 β－actin、TLR3、TLR4 和 TLR15 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍系列稀釋的β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的陽(yáng)性cDNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行real－time PCR，得到檢測(cè)用 β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的熒光定量PCR溶解曲線（圖1）和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

Y＝－4.017＊log（x）＋0.67，R2＝0.998；Y＝－4.128＊log（x）＋6.33，R2＝0.996；Y＝－4.097＊log（x）＋14.31，R2＝0.991；Y＝－4.089＊log（x）＋9.33，R2＝0.997

圖1 TLR3、TLR4、TLR15及 β－actin基因的SYBR Green I rea－l time PCR 溶解曲線

溶解曲線表明，擴(kuò)增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰，其Tm值介于82.6℃～87.6℃之間。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程表明，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到0.991以上，且TLR3、TLR4和TLR15與β－actin曲線斜率值相差小于0.1，可用于β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的mRNA水平相對(duì)定量分析。

3.2 TLR3、TLR4和TLR15相對(duì)熒光定量結(jié)果分析 如圖2所示。與對(duì)照組相比，BBMC中TLR3的mRNA表達(dá)水平在IBDV感染后1d和感染后5 d均上調(diào)，差異顯著（P≤0.05），PBMC中僅在感染后1d顯著上調(diào)；感染后15dBBMC中TLR3恢復(fù)到正常水平，而PBMC中TLR3表達(dá)仍極顯著高于對(duì)照組（P≤0.01）。

差異顯著（P≤0.05），PBMC中 TLR4的 mRNA表達(dá)水平在感染后始終高于對(duì)照組，且在感染后15d極顯著高于對(duì)照組（P≤0.01）。BBMC中TLR15的mRNA表達(dá)水平在感染后1d顯著高于對(duì)照組（P≤0.05），感染后5d和15d無(wú)顯著差異；而PBMC中TLR15mRNA表達(dá)水平在感染后1d極顯著高于對(duì)照組（P≤0.01），在感染后5d和15d未檢測(cè)到。

圖2 感染后不同時(shí)間BBMC和PBMC中TLR3／4／15mRNA水平

4 討論

Toll樣受體是固有免疫中重要的識(shí)別受體，在機(jī)體識(shí)別各種病原微生物方面起著重要的作用。檢測(cè)Toll樣受體在感染初期（1dpi）、急性感染期（5dpi）與恢復(fù)期（15dpi）的 mRNA 表達(dá)水平變化，可探討IBDV感染對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的影響。本試驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，構(gòu)建了內(nèi)參基因β－actin及TLR3、TLR4、TLR15的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用內(nèi)參基因β－actin消除mRNA的提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率間的差異，結(jié)果可信度高，為檢測(cè)雞TLR3、TLR4、TLR15的表達(dá)水平提供了方法。

TLR3主要識(shí)別雙鏈RNA分子，在人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身性免疫性疾病中的表達(dá)上調(diào)［9］。劉爵等應(yīng)用間接免疫熒光和免疫印記技術(shù)驗(yàn)證在TLR3基因沉默的細(xì)胞里，病毒VP2蛋白表達(dá)量下降，細(xì)胞中病毒滴度下降［10］，表明 TLR3在IBDV感染過程中起重要作用。本試驗(yàn)中，BBMC和PBMC中TLR3mRNA表達(dá)水平在不同的時(shí)間段均表達(dá)上調(diào)，且差異顯著，推測(cè)TLR3可能在機(jī)體識(shí)別病毒中起作用。TLR4存在于多種細(xì)胞中，主要識(shí)別細(xì)菌的脂多糖，近年來有哺乳動(dòng)物在病毒感染中TLR4表達(dá)量變化的報(bào)道［11］，證明TLR4在病毒的免疫防御中有重要作用，推測(cè)TLR4在禽類病毒感染中可能有相似的作用。本試驗(yàn)中，BBMC和PBMC中，TLR4mRNA表達(dá)在急性感染期及恢復(fù)期均顯著上調(diào)，提示TLR4參與了IBDV感染過程中機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，IBDV感染后引起的腔上囊急性損傷可能與TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。TLR15是禽類特有的Toll樣受體，有報(bào)道雞感染馬立克等病毒后也導(dǎo)致TLR15表達(dá)上調(diào)［12］。本試驗(yàn)顯示，BBMC和PBMC中TLR15的mRNA表達(dá)水平在感染后1d均顯著高于對(duì)照組，表明TLR15在感染初期識(shí)別IBDV感染中起到重要作用。此后，TLR15在BBMC中恢復(fù)至正常水平，而在PBMC中未檢測(cè)到，提示IBDV感染后期PBMC中TLR15mRNA表達(dá)受到抑制。最近有報(bào)道，球蟲感染的雞腸道TLRs的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致雞腸道免疫功能紊亂，增加機(jī)體對(duì)其他疾病的易感性［13］，推測(cè)TLR15在IBDV感染中有相似的作用。

綜合分析表明，IBDV感染后雞腔上囊單個(gè)核細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中TLR3、4、15mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，提示IBDV感染早期激活了機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒作用，其識(shí)別病毒的機(jī)理及在免疫應(yīng)答中的作用有待于進(jìn)一步研究。

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