鵝源坦布蘇病毒的分離及初步鑒定

施少華，傅光華，萬春和，程龍飛，陳紅梅，黃振洲，黃 瑜

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福建 福州350013；3.廣東省江門市臺山都斛西敦獸醫服務部，廣東 江門529226）

2010年春夏之交，我國部分地區種鴨和蛋鴨發生以突發產蛋急劇下降為特點一種疾病。研究人員從表現產蛋驟降的病死禽中采集其卵巢、肝臟、腦等進行病毒分離，經對所分離的病毒進行形態學觀察、理化特性測定、RT－PCR檢測及序列分析明確該病病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）［1－6］。之后相繼有雞和鵝感染TMUV的病例報告［7－9］。

2011年5～6月，廣東江門的部分養鵝場20～30日齡雛鵝發病，臨床癥狀主要表現為搖頭、軟腳，剖檢可見肝臟出血、壞死，個別有心肌出血等現象。我們從患病鵝中分離到1株病毒，經RT－PCR檢測和序列分析表明該病毒為TMUV。

1 材料與方法

1.1 酶、試劑 Trizol reagent RNA提取液，購自Invitrogen公司，反轉錄酶AMV Reverse Transcriptase、RNA酶抑制劑 Ribonuclease Inhibitor、dNTP Mix、DNA Marker DL－2 000和pMD18－T載體，均購自寶生物工程（大連）有限公司，2×PCR Master Mix，購自Fermentas公司，瓊脂糖凝膠回收小量試劑盒、質粒小量抽提試劑盒，購自Omiga公司。大腸桿菌DH5α感受態細胞自制。

1.2 試驗禽胚、試驗動物及血清 13日齡鵝胚，購自廣東江門某孵化場，10日齡番鴨胚購自福建莆田某孵化場。3日齡長樂灰鵝，購自福建長樂某養鵝場。抗鴨TMUV血清由鴨TMUV WR株免疫麻鴨制得。

1.3 病原分離 無菌采集呈典型病變的雛鵝肝臟，處理后接種于血瓊脂平板培養基，于37℃有氧或燭缸培養48h，觀察有無細菌生長。同時將雛鵝的肝臟剪碎后按照組織重量1∶4加入滅菌PBS，反復凍融3次后8 000r／min離心5min，取上清用0.22μm的過濾器除菌，濾過液經尿囊腔接種13日齡鵝胚6枚，0.2mL／胚；同時接種滅菌PBS作為對照。每天觀察3次，棄24h內死胚。收集24～120h死亡鵝胚的尿囊液，進行無菌檢查和雞紅細胞凝集試驗后，－20℃保存備用。

1.4 病毒在番鴨胚的傳代 將鵝胚的尿囊液接種10日齡番鴨胚4枚，0.2mL／胚；同時接種滅菌PBS作為對照。每天觀察3次，棄24h內死胚，收集24～96 h死亡鴨胚的尿囊液，進行無菌檢查和雞紅細胞凝集試驗后，－20℃保存備用。

1.5 鴨胚半數致死量（ELD50）的測定 將待測病毒液用滅菌生理鹽水作10－1～10－6稀釋，分別接種于10日齡番鴨胚尿囊腔中，每個稀釋度接種5枚，每枚0.2mL。每天照蛋2次，24h內死亡的鴨胚廢棄不計，以后每天記錄死亡情況，連續觀察7d，按Reed－Muench法計算病毒對番鴨胚的ELD50。

1.6 中和試驗 將新鮮病毒尿囊液按1∶10稀釋，與已知的抗鴨TMUV血清等量混合，并用1∶10病毒液與滅菌生理鹽水等量混合作對照。混合后置37℃1h，分別接種10日齡鴨胚，每枚0.2mL，每組5枚。每天觀察3次，棄24h內死胚，共觀察7d。

1.7 動物回歸試驗 將20只3日齡長樂灰鵝隨機分成2組，每組10只。飼養觀察7d后，A組肌肉注射新鮮病毒尿囊液，每只1mL，B組肌肉注射滅菌生理鹽水，每只1mL。隔離飼養，每天觀察2次，連續觀察14d。

1.8 RT－PCR鑒定及序列分析

1.8.1 引物設計與合成 參照文獻［10］合成可擴增469bp的鴨TMUV NS5基因片段的引物，由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.8.2 RNA提取及反轉錄 取病毒株感染的番鴨胚尿囊液于10 000r／min（4℃）離心10min以去除雜質，收集上清液參照Trizol reagent說明書操作對病毒RNA進行提取，最后每250μL尿囊液的病毒RNA用5μL DEPC水溶解。反轉錄按AMV Reverse Transcriptase說明書進行，具體如下：將制備好的RNA 5μL，加入200pmol／μL隨機引物1μL，AMV RT 5×Buffer 4μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 8μL，40U／μL Ribonuclease Inhibitor 1μL，AMV Reverse Transcriptase 1μL，混勻后按以下程序進行RT：42℃60min，99℃5min，保存于4℃。

1.8.3 PCR擴增 PCR反應體系為25μL：取2μL反轉錄產物，2× PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，dd H2O補齊至25μL后按以下程序進行PCR：95℃變性3min后，94℃變性40s，55.3℃退火40s，72℃延伸40s，共35循環，最后72℃延伸10 min，保存于4℃。PCR產物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8.4 其他病原的排除 參照禽流感病毒、禽1型副黏病毒、鵝細小病毒、鴨甲肝病毒1型、鴨甲肝病毒3型、番鴨呼腸孤病毒、新致病型鴨呼腸孤病毒基因序列設計引物，提取GD06株病毒的核酸，分別進行PCR或RT－PCR擴增。

1.8.5 克隆測序 PCR產物回收純化后連接到pMD18－T載體，轉化入DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12～16h，挑取單個菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃、200r／min振蕩過夜，取2μL菌液進行PCR鑒定，結果陽性者送至上海英駿生物技術有限公司測序。

1.8.6 序列比對分析 將所獲得的測序結果用DNAStar軟件包MegAlign程序進行比對，并通過MEGA 4.0分析遺傳進化關系。參考毒株及其登錄號：JS804株（JF895923），BYD－1株（JF312912），SD株（JN232077），Huabei株（JF523187），TMUV 14／6／82株（EU303233），以色列火雞腦膜炎病毒（Israel turkey meningoencephalitis virus，ITV）（AF013377）。

2 結果

2.1 病原分離 從病死鵝肝臟取樣接種于血瓊脂平板，37℃培養后48h未發現有細菌生長，初步排除細菌感染的可能。病料樣品接種鵝胚后在72h左右死亡，收集死亡鵝胚的尿囊液，經檢驗無細菌污染和病毒無血凝活性，暫命名為GD06株。

2.2 ELD50的測定 將待測病毒液用滅菌生理鹽水作10－1～10－6共6個稀釋度，分別接種于10日齡番鴨胚尿囊腔中，連續觀察7d，算出ELD50＝10－1.84／0.2mL。

2.3 中和試驗 將新鮮病毒尿囊液按1∶10稀釋，與已知的抗鴨TMUV血清等量混合，置37℃1h，接種鴨胚，第3天有死胚1枚，而1∶10病毒液與滅菌生理鹽水等量混合后接種鴨胚，7d內全部死亡。

2.4 動物回歸試驗 A組肌肉注射新鮮病毒尿囊液后死亡2只，剖檢鵝肝臟有出血、壞死，將病變組織勻漿后接種10日齡鴨胚，可致鴨胚死亡，用RT－PCR檢測結果為陽性，撲殺其他健活鵝未發現有明顯的剖檢病變。B組肌肉注射滅菌生理鹽水無異常現象。

圖1 鵝TMUV GD06株的RT－PCR／PCR檢測

2.5 RT－PCR或PCR鑒定 用特異性引物對GD06株進行擴增，產物的電泳結果見圖1。如圖1所示，鴨TMUV特異性引物能成功擴增出1條約500bp的電泳條帶，且空白對照無特異性條帶。其他特異性引物均未能成功對其擴增出目的片段。

2.6 基因序列分析 將所擴增的目的片段進行回收純化、克隆測序，經BLASTP檢索可知，所克隆的基因片段與TMUV具有較高的同源性。對所獲序列進行比對，結果見表1，分離株GD06與鵝源TMUV JS804株的核苷酸同源性高達99.8%，與鴨源TMUV（WR株、BYD－1株和SD株）核苷酸同源性分別為99.1%、99.8%和99.8%；與雞源TMUV FQ－C1株的同源性高達98.5%，而與TMUV 14／6／82株的同源性為88.3%，與ITV的同源性為76.1%（TMUV與ITV的同源性則為74.4%）；氨基酸同源性比較表明，GD06株與BYD－1株、SD株、JS804株和Huabei株的同源性達100%，與雞源TMUV FQ－C1株的同源性為98.1%，與TMUV的同源性也達96.8%。如圖2所示，GD06株與鴨源、鵝源和雞源TMUV的遺傳進化關系近，它們共聚為同一分支，但與TMUV和ITV分立不同的進化分支。

3 討論

黃病毒是一類具有囊膜的單鏈RNA病毒，包括黃熱病病毒、乙型腦炎病毒、登革熱病毒、坦布蘇病毒、森林腦炎病毒、以色列火雞腦膜炎病毒等。吸血的節肢動物，例如蚊和蜱等是黃病毒屬的主要傳播媒介。

表1 水禽源TMUV毒株之間及其與TMUV和ITV參考毒株之間NS5基因的同源性

圖2 基于TMUV NS5基因構建的進化樹

本試驗自表現神經癥狀、軟腳的病死鵝臟器中分離到病毒GD06株，經對分離的病毒株進行RTPCR鑒定及序列分析表明，初步確定GD06株病毒為TMUV。ELD50的測定結果顯示，GD06株的毒力較低，進行血清中和試驗時0.2mL的病毒液無法達到200ELD50的毒價，所以僅能進行簡單的定性中和試驗，其結果說明GD06株病毒與鴨TMUV抗原相關性強，動物回歸試驗也證明GD06株毒力弱。

序列分析表明，分離株GD 0 6與鵝源TMUV JS804株、鴨源TMUV（BYD－1株SD株）有極高的核苷酸（99.8%）及氨基酸（100%）同源性，但這三者之間宿主嗜性、致病性差異等關系如何需更加深入的研究。

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