綿羊絳蟲玻片標本的制作方法

馬力克·艾則孜

（新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，新疆 烏魯木齊830063）

綿羊絳蟲是一種長帶狀、有許多扁平節片體組成的蠕蟲，寄生在綿羊的小腸上。分莫尼茨絳蟲、曲子宮絳蟲和無卵黃腺絳蟲3種。寄生蟲標本在寄生蟲學的教學、科研、寄生蟲病的診斷和防治工作中有十分重要的作用。將寄生蟲制成玻片標本，可延長標本的保存時間，且可顯示原始狀態下難以觀察的結構，是鑒別寄生蟲蟲種的重要手段與方法。根據寄生蟲標本自身特性，一個永久性標本的制作過程包括固定、染色、脫水、透明和封片等5大步驟。但具體到不同蟲種，其實際操作步驟亦有所不同。因此制作結構清晰、顏色鮮亮的絳蟲染色標本是非常重要的。現以綿羊體內莫尼茨絳蟲為研究對象，通過幾種染色液染色效果的比較，參考一些相關的研究方法，經過多次摸索，對莫尼茨絳蟲成蟲制片方法進行了探索。

1 材料與方法

1.1 試驗標本 于2011年4月至5月采自新疆克拉瑪依市小拐牧場，伊犁哈薩克小羊，在小腸內采集莫尼茨絳蟲。

1.2 試劑 卡紅，蘇木素精，酒精，濃鹽酸，濃氨水，硼砂，銨明礬，甘油，甲醇，二甲苯，加拿大樹膠等。

1.3 方法

1.3.1 染色液的配制方法 蘇木素染液配制方法：將蘇木素4g溶于95%酒精25mL中，再向其中加入400mL飽和銨明礬溶液。將此混合液暴露于日光及空氣中3～7d，待其充分氧化成熟，再加入甘油100mL和甲醇100mL保存，待其顏色充分變暗，濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。

鹽酸卡紅染液配制方法：蒸餾水15mL加濃鹽酸2mL，煮沸，趁熱加入卡紅染粉4g，再加入85%酒精95mL，滴加濃氨水中和，待出現沉淀為止，放冷，濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。

硼砂卡紅染液配制方法：以4%硼砂溶液100 mL，加入卡紅1g，加熱溶解后，待冷，再加入70%酒精100mL，濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。

1.3.2 標本的采集和固定 莫尼茨絳蟲是寄生于牛羊的小腸內，采集標本時應輕拉輕拽，切勿將蟲體拽斷，可將附著有蟲體的腸段剪下，連同蟲體浸入清水中，2～3h后，蟲體會自行脫落。

壓片固定 將采集的蟲體剪成1.5cm左右的小段，壓入兩潔凈的載玻片中間，為了不使蟲體壓的過薄，可在載玻片兩端墊以適當厚度的紙片，用線繩扎緊載玻片兩端，投入70%酒精中固定24～48h。

1.3.3 染色方法 （1）蘇木素染色法：洗脫酒精后將壓片固定好的蟲體投入梯度酒精中，50%酒精（30min）→30%酒精（30min）→蒸餾水（10min）。染色：使用染色液的稀釋倍數分別為10倍和15倍。兩個不同濃度的染色液分別采用不同的染色時間：3 h，6h，12h，16h。脫水：將蟲體從染液中取出，用蒸餾水洗去浮色，依次投入30%，50%，70%梯度酒精中，每級酒精脫水20min。分色：用鹽酸酒精分色5～10min。鹽酸酒精是80%酒精100mL加入2mL濃鹽酸。脫水：依次投入80%，90%，95%，100%Ⅰ，100% Ⅱ梯度酒精中，每級酒精20min。透明：將蟲體移入100%二甲苯中透明1～2min。封固：用加拿大樹膠封固。（2）鹽酸卡紅和硼砂卡紅染色法：將壓片固定好的蟲體直接投入染色液中染色，染色時間為：3h，6h，12h，16h。用鹽酸酒精分色5～10min。依次投入80%，90% ，95%，100% Ⅰ，100% Ⅱ梯度酒精中，每級酒精20min。將蟲體移入100%二甲苯中透明1～2min。用加拿大樹膠封固。

2 結果與分析

采用3種不同的染色液、不同的染色液濃度和染色時間，并摸索了脫水、分色和透明的時間，對制作的莫尼茨絳蟲成蟲染色標本的染色效果進行了比較（見表1）。

比較結果表明，用蘇木素染色液所得染色標本結構清晰，效果最好；其中1∶15蘇木素染液染色的成節中，卵巢、卵黃腺、睪丸、節間腺、縱排泄管等器官著色均勻，結構清晰，對比鮮明。孕卵節片中子宮、蟲卵、節間腺等結構也很清晰。最佳的染色程序為：70%酒精壓片固定24～48h→50%酒精（30 min）→30%酒精（30min）→蒸餾水（10min）→蘇木素染色液1∶15稀釋液（12h）→用蒸餾水洗去浮色→30%酒精（20min）→50%酒精（20min）→70%酒精（20min）→鹽酸酒精（5～10min）→80%酒精（20min）→90%酒精（20min）→95%酒精（20 min）→100%酒精Ⅰ（10min）→100%酒精Ⅱ（10 min）→二甲苯（1～2min）→加拿大樹膠封固。用鹽酸卡紅染色液和硼砂卡紅染色液染制的標本蟲體內部各器官和其他組織均呈亮紅色，對比性差，結構分辨不清楚。

表1 不同濃度染液和染色時間對莫尼茨絳蟲成蟲的染色效果比較

3 結論

絳蟲的染色方法有多種，但蘇木素染色液是組織化學和免疫組織化學中最常用的染料之一，但不能直接用來染色，必須暴露在空氣中變成氧化蘇木精（蘇木素）后才能使用。蘇木素在空氣中暴露一般為3～7d后即可使用，配制后時間愈久，著色力愈強。試驗也顯示，用蘇木素染色法制作絳蟲成蟲染色標本，同樣可收到好的效果。用此方法制作的莫尼茨絳蟲成節中雌雄生殖系統、排泄系統、節間腺結構清晰，孕節中子宮和蟲卵的結構也較容易辨認。蘇木素染色法操作比較簡單，其關鍵點是染色、分色、脫水和透明的時間。染色時間宜長不宜短；分色要恰到好處，顏色不能過重也不能過淺；脫水要充分，在高濃度酒精中時間不能太長，高濃度酒精很容易使染好的標本變脆；透明時間1～2min即可，時間太長染出的標本會變得很脆，不宜封片。蘇木素染色液性能穩定，重復使用效果也很好，陳舊的蘇木素染色液可經過濾等方法去除染色液中的沉渣后仍可使用。因此，采用蘇木素染色法，不但提高了莫尼茨絳蟲成節的染色效果，對其他種類絳蟲成節標本的染色效果提高也可能有一定參考意義。

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