正相超高壓液相色譜法測定植物油中的維生素E

張 征 徐春祥 劉佳娣，2 許書軍

正相超高壓液相色譜法測定植物油中的維生素E

張 征1徐春祥1劉佳娣1，2許書軍1

(江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院1，南京 210007)
(南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院2，南京 210009)

采用正相超高壓液相色譜法測定油脂中4種常見生育酚的含量，確定一種簡單、準(zhǔn)確、快速測定維生素E的測定方法。樣品經(jīng)前處理后，用Zorbax RX－SIL硅膠柱分離，以乙酸乙酯－異辛烷為流動相梯度洗脫，在波長295 nm采用外標(biāo)法檢測α、β、γ、δ等四種生育酚在不同植物油中的含量。研究結(jié)果表明，該方法四種異構(gòu)體均在8 min內(nèi)出峰，線性關(guān)系在0．999 4～0．999 9間，精密度RSD＜5%，加標(biāo)回收率在80%～100%，線性范圍0．2～100．0μg/mL，α、β、γ、δ異構(gòu)體方法檢出限均在0．01μg/g左右;幾種典型植物油樣品驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明該方法體系具有快速、準(zhǔn)確、分離度好等特點(diǎn)。同時比較了調(diào)和油和精煉地溝油維生素E含量差異，初步確定α－維生素E可能作為該類地溝油識別因子。

正相超高壓色譜 維生素E α－生育酚 精煉廢棄油脂

維生素E，又名生育酚，是一類能夠顯示D－α－生育酚生物活性的衍生物的總稱。天然維生素E主要有八種異構(gòu)體，為α－、β－、γ－、δ－等相應(yīng)生育酚和三烯酚，生育酚最為常見［1］。維生素E不但是天然的抗氧化劑，而且具有抗衰老、預(yù)防動脈硬化和心血管疾病等多種生理功能［2］。通常情況下，α－生育酚的生理活性最強(qiáng)，β－和γ－生育酚不及α－生育酚的一半活性，δ－生育酚幾乎沒有活性，而抗氧化能力則是α＜β＜γ＜δ［3］。維生素E的主要來源是植物油和胚芽油，如麥胚油、玉米胚芽油、棉籽油、花生油和芝麻油等。因此，維生素E的組成和含量可以作為食用植物油脂品質(zhì)的一個重要評價指標(biāo)［4］。

維生素E的分析方法包括比色法、光譜法、紙層析法、柱層析法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等［4－7］。目前，國際上通用的維生素E多采用液相色譜法［8－9］，我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009．82—2003《食品中維生素A和維生素E的測定》和GB 5413．9—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定》以及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1598—2008《食用油中維生素E組分和含量的測定高效液相色譜法》等，都是采用液相色譜法。以上標(biāo)準(zhǔn)樣品處理均采用皂化的方法提取維生素E，后采用反相液相色譜法測定含量。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，尚未見運(yùn)用超高壓液相色譜對維生素E的測定方法研究報導(dǎo)。本論文將探討采用正相超高壓色譜直接測定幾種食用油中維生素E含量，建立一種食用油中維生素E快速測定方法體系，并運(yùn)用該方法探討幾種食用油脂中維生素E的分布特征。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

正己烷(分析純)，無水乙醇、異辛烷、乙酸乙酯:色譜純，國藥集團(tuán);維生素E的四種生育酚異構(gòu)體(α、β、γ、δ，單標(biāo)):純度＞98．0%，美國Sigma－Aldrich公司。

Lambda 25紫外可見分光光度計:美國PE公司;HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;AE163電子分析天平:瑞士Mettler公司;1290超高壓液相色譜－紫外檢測器，其中色譜柱為zorbax RX－SIL(250 mm×4．6 mm，2．5μm):美國Agilent公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 樣品溶液的配置

定制成品大豆油、葵花籽油、亞麻籽油、橄欖油、菜籽油、調(diào)和油，另外市場購買芝麻油(5種品牌)以及1個查獲的地溝油樣品。分別準(zhǔn)確稱取各樣品2．0 g(精確至0．000 1g)，經(jīng)正己烷定容至25 mL，過0．45μm微孔濾膜，用于正相色譜分析。

1．2．2 色譜條件

流動相A為純異辛烷，流動相B為純乙酸乙酯，采用梯度洗脫(B%):0～8 min;8－8．5 min，9→15;8．5～9 min，15→20;9～10 min，20→30，保留5 min;15～15．5 min，30→9，保留4．5 min。流 速 為1 mL/min，紫外檢測波長295 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

1．2．3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

精確稱取α、β、γ、δ－生育酚分別100 mg，溶于正己烷并定容至100 mL，配置成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液(有效期2個月)。每次試驗(yàn)前，標(biāo)準(zhǔn)貯備液配置100μg混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，臨時配制。吸取生育酚標(biāo)準(zhǔn)使用液配置濃度分別為0．5、1、10、25、50、100 μg/mL的混標(biāo)溶液。以生育酚濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并同時建立線性回歸方程(表1)。

表1 維生素E的線性方程與方法檢出限

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件

本試驗(yàn)的主要目的是研究和建立正相超高壓液相色譜測定油脂中維生素含量的方法。樣品經(jīng)過正己烷直接抽提后，用硅膠柱zorbax RX－SIL直接分離維生素E的四種異構(gòu)體。在諸多色譜條件中，流動相的選擇是分析方法研發(fā)的重點(diǎn)。流動相中乙酸乙酯的比例對異構(gòu)體保留時間有較大影響，比例為30%時，α、β、γ未能有效分離;降低至9%時，獲得最佳分離效果，分離度均大于1．5，待測物質(zhì)均在8分鐘內(nèi)出峰，因此選擇該比例進(jìn)行樣品分析(見圖1所示)。由于樣品未經(jīng)過固相萃取過濾，雜質(zhì)較多，因此選擇8 min后梯度洗脫，以減少平衡時間(具體設(shè)定見1．2．2)。

圖1 流動相比例對四種生育酚的保留時間影響

2．2 線性關(guān)系與方法檢出限

標(biāo)準(zhǔn)品用正己烷配置成系列溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，方程和相關(guān)系數(shù)見表1。相關(guān)系數(shù)在0．999 4～0．999 9之間，表明幾種維生素E質(zhì)量濃度在0．5～100μg/mL的范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。以信噪比S/N=3計算儀器最低檢測限，再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)確定方法的檢測線限，算得維生素E檢測限在0．10～0．19之間。

2．3 方法的重現(xiàn)性、回收率與精密度

取標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)連續(xù)進(jìn)樣5次，計算峰面積之間的RSD，用來確定儀器精密度。結(jié)果顯示，α、β、γ、δ的RSD分別為1．462%、0．848%、1．248%、0．805%，均小于2%，重現(xiàn)性良好。用芝麻油進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行5份，計算方法回收率及精密度。結(jié)果顯示，在線性范圍內(nèi)，α、β、γ、δ的平均回收率分別為90．64%、80．19%、92．63%、95．50%，在80%～100%范圍內(nèi);RSD分別為4．60%、4．28%、4．99%、4．84%，均在5%范圍以內(nèi)。以上顯示，該方法具有良好的重現(xiàn)性和精密度，能夠開展植物油脂中的維生素E分布特征測定研究。

2．4 樣品實(shí)測結(jié)果

選取8種植物油樣品用高效液相色譜法分別測定4種生育酚含量，按上述樣品處理與色譜方法，測定幾種油脂中的維生素E含量，結(jié)果見表2。所選樣品中大豆油生育酚總含量最高，達(dá)到1．4 mg/g，橄欖油總含量最低，僅有0．2 mg/g;芝麻油中主要含有γ－生育酚，其他3種生育酚含量很低;菜籽油中主要含有α，γ－生育酚，橄欖油中主要含有α－生育酚，亞麻籽油中δ－生育酚含量很低，葵花籽油中主要含有α－生育酚，大豆油中則幾乎不含β－生育酚，各單一植物油中生育酚組分含量有明顯區(qū)別。比較調(diào)和油和地溝油維生素E組成發(fā)現(xiàn)(圖2)，地溝油樣品中幾乎不含α－生育酚。由于α－生育酚的抗氧化能力最弱，即還原能力最弱，在地溝油精煉過程中易被轉(zhuǎn)化為其他異構(gòu)體形式，因此推測α－生育酚可能作為精煉地溝油的一種標(biāo)示物。

表2 幾種典型植物油的方法驗(yàn)證結(jié)果(n=3;RSD＜5%)

圖2 典型油脂調(diào)和油和精煉地溝油液相色譜圖

3 結(jié)論

3．1 選用zorbax RX－SIL柱正相分離生育酚，以異辛烷－乙酸乙酯為流動相，梯度洗脫，在295 nm波長下檢測，獲得較理想的分離效果。

3．2 運(yùn)用建立的測定方法調(diào)查了幾種選定食用油脂，證明方法重現(xiàn)性好，且各種不同食用油中生育酚各組分及總量有明顯區(qū)別，可用于質(zhì)量分級和營養(yǎng)評價。

3．3 比較調(diào)和油和精煉廢棄油脂維生素E組成發(fā)現(xiàn)，精煉后的廢棄油脂中未檢出α－生育酚，該指標(biāo)可能作為精煉地溝油標(biāo)示物，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Determination of Vitamin E in Edible Plant Oil by Normal Phase Ultra Performance Liquid Chromatography

Zhang Zheng1Xu Chunxiang1Liu Jiadi1，2Xu Shujun1

(Jiangsu Provincial Supervising and Testing Institute for Products Quality1，Nanjing 210007)
(College of chemistry and chemical engineering，Nanjing University of Technology2，Nanjing 210009)

A simple extraction procedure using liquid－liquid extraction coupled with normal phase ultra performance liquid chromatography(NP－UPLC)to determine four tocopherols from vegetable oils was developed．Using Zorbax RX－SIL，α，β，γ，andδtocopherols were separated by NP－UPLC within 10 min through degraded dilution conditions．The results demonstrated that the new method established in this paper had a linearity ranging from0．9994 to 0．9999．Recovery of this method changed between 80%and 100%and RSD was below 5%．Linearity range of the method for quantify vitamin E was0．2 to 100μg/mL and limitation of detection of the method was about 0．01μg/g．The assay was successfully applied to the analysis of several oil samples and find there significant difference inα －tocopherols content between regulatory oil and refined waster oil．We proposedα－tocopherols as a biomarker for distinguishing waster oil and the further study was undertaken．

NP －UPLC，vitamin E，α － tocopherol，refined waster oil

O657．7

A

1003－0174(2012)10－0109－04

時間:2012－08－29 10:25

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20120829．1025．002．html

國家質(zhì)檢總局資助項(xiàng)目(2009QK146)

2012－03－27

張征，男，1972年出生，高級工程師，食品安全與質(zhì)量監(jiān)管

許書軍，男，1977年出生，高級工程師，食品化學(xué)與營養(yǎng)評價