廣東部分豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查

臧瑩安，龐木生，黃彩梅，李 淼，宋 帥，李春玲

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，廣東 廣州510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東 廣州510640；3.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510640）

副豬嗜血桿菌病是由HPS引起的一種嚴(yán)重的全身接觸性傳染病，近年來該病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，可與其他豬病原體混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。對(duì)副豬嗜血桿菌的檢測(cè)主要通過細(xì)菌分離鑒定、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等手段進(jìn)行［2］。針對(duì)副豬嗜血桿菌外膜蛋白P2的間接ELISA檢測(cè)方法是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病研究室近期研究建立起來的新型檢測(cè)方法，原理是選用超聲裂解抗原作為包被抗原，通過對(duì)抗原、血清包被濃度、酶結(jié)合物稀釋濃度、作用時(shí)間、抗原抗體結(jié)合時(shí)間、封閉時(shí)間、底物顯色時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立HPS間接ELISA抗體檢測(cè)方法。該方法克服了上述檢測(cè)方法的缺陷，具有針對(duì)性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確、檢測(cè)費(fèi)用低等特點(diǎn)。

本次調(diào)查應(yīng)用該間接ELISA法對(duì)廣東省部分豬場(chǎng)的豬副豬嗜血桿菌病的進(jìn)行了抽樣檢測(cè)，考證廣東部分地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行情況的影響，為臨床上準(zhǔn)確有效地檢測(cè)和監(jiān)控副豬嗜血桿菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 分別于2010年秋季（8、9、10月份）和冬季（11、12、1月份），在廣東豬場(chǎng)采集血清376份，通過現(xiàn)場(chǎng)隨機(jī)或豬只死亡后2h內(nèi)采集送樣的方式收集豬血樣。對(duì)疫苗免疫豬場(chǎng)，豬群首免后1個(gè)月采集血樣。共采集血清樣品487份。其中免疫過的豬血清53份，未免疫過的豬血清434份；母豬血清53份，哺乳仔豬血清141份，保育仔豬血清131份，育肥仔豬血清162份。

1.2 待檢血清的制備 從前腔靜脈或耳緣靜脈每頭豬采集5mL血液（不加抗凝劑）。室溫靜置2h后，5 000r／min離心10min，取上清液置于EP管中。對(duì)于沒有條件分離血清的地區(qū)，室溫靜置，讓其自然析出血清，處理好的血清置于冰箱中3℃～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與設(shè)備 Costar－2592副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測(cè)96孔V型反應(yīng)板；168－1000XC，BIO RAD酶標(biāo)儀；Epson EPL－5700打印機(jī)；FC－16C高速離 心 機(jī)；Centrifnge.5418 低 速 離 心 機(jī)；Sartorius BP121S電子天平；美國Costar孔酶標(biāo)板；Unique－R20超純水系統(tǒng)；海爾 BCD－258WDCSH 冰箱；PSX－280B手提式高壓滅菌鍋，均購自上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；ZW－A微量震蕩器，購自江蘇金壇新一佳儀器廠。

1.4 主要試劑 抗原為HPS OMP2基因表達(dá)并純化復(fù)性后蛋白，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒；酶標(biāo)記抗體（羊抗豬）；牛血清白蛋白（凍干粉）。包被緩沖液；洗滌緩沖液；抗體稀釋液；底物緩沖液；TMB底物顯色液；終止液。

1.5 試驗(yàn)方法 用純化復(fù)性后的HPS OMP2蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應(yīng)板，建立間接ELISA方法，首先進(jìn)行方陣滴定以確定抗原和血清的最佳工作濃度，然后以最佳稀釋度包被抗原1.5μg／mL進(jìn)行包被后，進(jìn)行酶聯(lián)免疫法（ELISA）的基本操作程序。測(cè)定各孔OD450nm值。

1.6 結(jié)果判定 終止反應(yīng)后20min內(nèi)，測(cè)定450nm波長的OD值。在（陽性對(duì)照平均OD值－空白對(duì)照平均OD值）／（陰性對(duì)照平均OD值－空白對(duì)照平均OD值）＞0.235的前提下。用（測(cè)定樣品孔的平均OD值－空白對(duì)照平均OD值）／（陰性孔中的平均OD值－空白對(duì)照平均OD值）（P／N值）判定結(jié)果：當(dāng)P／N＞0.235時(shí)，判定為陽性，否則為陰性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同地區(qū)豬場(chǎng)HPS的感染情況 由表1可知，HPS在增城、從化和鶴山均能檢出，且各豬場(chǎng)差異極顯著（P＜0.01）。其中增城檢出率最高（30.9%），從化次之（21.3%），鶴山最低（13.7%），平均陽性率達(dá)23.8%。

2.2 不同日齡的豬HPS的感染情況 由表2可知，各地區(qū)豬場(chǎng)不同日齡的豬感染HPS情況均較為嚴(yán)重。其中育肥豬的平均陽性檢出率最高（33.6%）；母豬次之（31%）；哺乳仔豬最低（19.9%），差異極顯著（P＜0.01）。

表1 不同地區(qū)豬場(chǎng)HPS的感染情況

表2 不同日齡的豬HPS的感染情況

2.3 秋、冬季節(jié)HPS的感染情況 由表3可知，各豬場(chǎng)冬季HPS感染情況較嚴(yán)重，陽性檢出率在24.1%～31.4%之間，極顯著高于秋季的6.7%～18.7%（P＜0.01）。

表3 秋、冬季節(jié)HPS的感染情況

3 討論

目前，檢測(cè)HPS的方法很多，PCR技術(shù)是進(jìn)行病原檢測(cè)的常用方法，用血清學(xué)方法檢測(cè)抗體有利于大規(guī)模的普查和快速診斷。間接ELISA方法是血清學(xué)檢測(cè)方法中較為敏感、特異的方法，比間接血凝試驗(yàn)更準(zhǔn)確、敏感、客觀［3－4］。選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA檢測(cè)方法的關(guān)鍵，國內(nèi)石碧等［5］、王艷等［6］選用莢膜多糖、全菌體作為包被抗原分別建立了檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法，均取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果，可用于診斷和流行病學(xué)調(diào)查。經(jīng)超聲裂解的細(xì)菌菌液上清中含有大量菌體可溶性蛋白和多糖抗原，常作為各種血清學(xué)診斷方法所用的抗原，具有制備方法簡(jiǎn)單、易于控制質(zhì)量、廣譜和敏感性高的特點(diǎn)，國內(nèi)魏子貢等［7］用HPS超聲裂解抗原致敏紅細(xì)胞，建立了HPS抗體間接血凝檢測(cè)方法，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測(cè)及副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查。國內(nèi)尚未見用超聲裂解抗原建立檢測(cè)HPS抗體的間接ELISA方法的報(bào)道。因此，本次調(diào)查選用HPS間接ELISA抗體檢測(cè)方法是以超聲裂解副豬嗜血桿菌外膜蛋白（OMP）P2作為包被抗原，通過條件優(yōu)化的新方法。在廣東增城、從化、鶴山等地區(qū)部分豬場(chǎng)開展HPS的流行病學(xué)調(diào)查，初步了解廣東省部分地區(qū)的副豬嗜血桿菌的流行情況。

調(diào)查結(jié)果表明，廣東增城、從化、廣州地區(qū)的豬存在不同程度的場(chǎng)HPS感染，但不同豬場(chǎng)的HPS抗體陽性檢出率相差很大，平均感染率為23.8%。其中增城豬場(chǎng)的陽性檢出率最高（30.9%），從化豬場(chǎng)次之（21.3%），鶴山區(qū)豬場(chǎng)最低（13.7%）。造成這種情況的原因是各個(gè)豬場(chǎng)不同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件。比如，場(chǎng)內(nèi)的動(dòng)物防疫工作不是很嚴(yán)謹(jǐn)，沒有嚴(yán)格按照規(guī)范的消毒、免疫程序制定相應(yīng)的日常消毒和疾病防疫制度；豬場(chǎng)普遍選址不是很理想，有的豬場(chǎng)比較靠近高速公路，有的比較接近村莊。一般豬場(chǎng)的衛(wèi)生管理都不太理想，存在一些不合理因素，比如豬場(chǎng)建設(shè)不合理，空氣污染嚴(yán)重、通風(fēng)不良，豬場(chǎng)的管理人員并不是專業(yè)的獸醫(yī)人員，缺乏對(duì)豬及豬場(chǎng)的專業(yè)知識(shí)的了解，所以要控制該病，必須要加強(qiáng)飼料管理和豬的保健工作，搞好豬場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生，使豬的生長環(huán)境比如溫度，通風(fēng)，空氣等都保持在良好狀態(tài)，及時(shí)定期做好豬群疫病的監(jiān)測(cè)工作。

不同日齡階段的豬感染情況也不同，其中母豬陽性率高達(dá)34.5%；保育仔豬和育肥豬陽性檢出率較高，分別為46.1%和30.8%。母豬抗體陽性率和抗體水平較高，但母豬的臨床病例并不多見，這種現(xiàn)象在規(guī)模化豬場(chǎng)非常普遍，其根本原因是母豬對(duì)副豬嗜血桿菌有較強(qiáng)抵抗力。哺乳仔豬的抗體陽性率較低且和母豬的結(jié)果有一定程度的接近，主要是哺乳仔豬受母源抗體影響較大。目前，關(guān)于導(dǎo)致副豬嗜血桿菌病流行加強(qiáng)的因素仍不清楚。不過，早期斷奶以及三點(diǎn)飼養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用可能對(duì)副豬嗜血桿菌病在豬場(chǎng)內(nèi)的流行具有影響，尤其是對(duì)于副豬嗜血桿菌有毒力菌株在豬體內(nèi)的早期定居以及這些菌株在整個(gè)豬場(chǎng)的流行而言。對(duì)副豬嗜血桿菌全身感染所致保育豬死亡的控制有賴于準(zhǔn)確的診斷以及對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)內(nèi)傳染的流行病學(xué)研究［8－9］。盡管HPS的致病機(jī)理尚不十分清楚，但美國明尼蘇達(dá)大學(xué)Pijoan and Oliveira等認(rèn)為［10］，當(dāng)前Glasserps病的暴發(fā)流行與仔豬早期斷奶及豬感染豬繁殖與呼吸綜合征關(guān)系密切，即HPS在仔豬保育期死亡中的作用可分為原發(fā)性病原體和繼發(fā)性病原體。將副豬嗜血桿菌徹底清除出豬群的方法并不現(xiàn)實(shí)，因?yàn)楦必i嗜血桿菌本來就是上呼吸道的常在菌，1周齡前的仔豬鼻黏膜就可能有副豬嗜血桿菌的定居，所以通過早期斷奶來根除該菌是不可能的。在斷奶后很早就發(fā)病的豬群，可以對(duì)仔豬進(jìn)行給藥時(shí)和斷奶時(shí)免疫接種［11］，在死亡高峰出現(xiàn)較晚時(shí)（進(jìn)入保育舍4～6周）的豬群，則在仔豬斷奶時(shí)和斷奶后兩周進(jìn)行免疫。

了解特定豬場(chǎng)中病原的流行病學(xué)，是防制受害豬群中副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵。冬季的寒冷天氣是HPS感染的主要誘因，容易發(fā)生副豬嗜血桿菌病的流行。本次的調(diào)查結(jié)果印證了這一點(diǎn)。

本次的調(diào)查結(jié)果和李春玲等2008年的調(diào)查結(jié)果基本一致［12］，進(jìn)一步說明了副豬嗜血桿菌在廣東豬場(chǎng)的感染的普遍性和季節(jié)性。也間接說明了本次所用的針對(duì)副豬嗜血桿菌外膜蛋白P2（OMP P2）的間接ELISA法的準(zhǔn)確性和敏感性可用于HPS的快速診斷。

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