廣東部分豬場副豬嗜血桿菌病的流行病學調查

臧瑩安，龐木生，黃彩梅，李 淼，宋 帥，李春玲

（1.仲愷農業工程學院動物科學系，廣東 廣州510225；2.廣東省農業科學院獸醫研究所，廣東 廣州510640；3.廣東省獸醫公共衛生公共實驗室，廣東 廣州510640）

副豬嗜血桿菌病是由HPS引起的一種嚴重的全身接觸性傳染病，近年來該病的發病率呈上升趨勢，可與其他豬病原體混合感染，給養豬業造成較大的經濟損失［1］。對副豬嗜血桿菌的檢測主要通過細菌分離鑒定、瓊脂擴散試驗、補體結合試驗等手段進行［2］。針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P2的間接ELISA檢測方法是廣東省農業科學院獸醫研究所豬病研究室近期研究建立起來的新型檢測方法，原理是選用超聲裂解抗原作為包被抗原，通過對抗原、血清包被濃度、酶結合物稀釋濃度、作用時間、抗原抗體結合時間、封閉時間、底物顯色時間等條件進行優化，建立HPS間接ELISA抗體檢測方法。該方法克服了上述檢測方法的缺陷，具有針對性強、快速、準確、檢測費用低等特點。

本次調查應用該間接ELISA法對廣東省部分豬場的豬副豬嗜血桿菌病的進行了抽樣檢測，考證廣東部分地區副豬嗜血桿菌病流行情況的影響，為臨床上準確有效地檢測和監控副豬嗜血桿菌病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 分別于2010年秋季（8、9、10月份）和冬季（11、12、1月份），在廣東豬場采集血清376份，通過現場隨機或豬只死亡后2h內采集送樣的方式收集豬血樣。對疫苗免疫豬場，豬群首免后1個月采集血樣。共采集血清樣品487份。其中免疫過的豬血清53份，未免疫過的豬血清434份；母豬血清53份，哺乳仔豬血清141份，保育仔豬血清131份，育肥仔豬血清162份。

1.2 待檢血清的制備 從前腔靜脈或耳緣靜脈每頭豬采集5mL血液（不加抗凝劑）。室溫靜置2h后，5 000r／min離心10min，取上清液置于EP管中。對于沒有條件分離血清的地區，室溫靜置，讓其自然析出血清，處理好的血清置于冰箱中3℃～4℃保存備用。

1.3 儀器與設備 Costar－2592副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測96孔V型反應板；168－1000XC，BIO RAD酶標儀；Epson EPL－5700打印機；FC－16C高速離 心 機；Centrifnge.5418 低 速 離 心 機；Sartorius BP121S電子天平；美國Costar孔酶標板；Unique－R20超純水系統；海爾 BCD－258WDCSH 冰箱；PSX－280B手提式高壓滅菌鍋，均購自上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱，購自上海躍進醫療器械廠；ZW－A微量震蕩器，購自江蘇金壇新一佳儀器廠。

1.4 主要試劑 抗原為HPS OMP2基因表達并純化復性后蛋白，由廣東省農業科學院獸醫研究所提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒；酶標記抗體（羊抗豬）；牛血清白蛋白（凍干粉）。包被緩沖液；洗滌緩沖液；抗體稀釋液；底物緩沖液；TMB底物顯色液；終止液。

1.5 試驗方法 用純化復性后的HPS OMP2蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應板，建立間接ELISA方法，首先進行方陣滴定以確定抗原和血清的最佳工作濃度，然后以最佳稀釋度包被抗原1.5μg／mL進行包被后，進行酶聯免疫法（ELISA）的基本操作程序。測定各孔OD450nm值。

1.6 結果判定 終止反應后20min內，測定450nm波長的OD值。在（陽性對照平均OD值－空白對照平均OD值）／（陰性對照平均OD值－空白對照平均OD值）＞0.235的前提下。用（測定樣品孔的平均OD值－空白對照平均OD值）／（陰性孔中的平均OD值－空白對照平均OD值）（P／N值）判定結果：當P／N＞0.235時，判定為陽性，否則為陰性。

2 試驗結果

2.1 不同地區豬場HPS的感染情況 由表1可知，HPS在增城、從化和鶴山均能檢出，且各豬場差異極顯著（P＜0.01）。其中增城檢出率最高（30.9%），從化次之（21.3%），鶴山最低（13.7%），平均陽性率達23.8%。

2.2 不同日齡的豬HPS的感染情況 由表2可知，各地區豬場不同日齡的豬感染HPS情況均較為嚴重。其中育肥豬的平均陽性檢出率最高（33.6%）；母豬次之（31%）；哺乳仔豬最低（19.9%），差異極顯著（P＜0.01）。

表1 不同地區豬場HPS的感染情況

表2 不同日齡的豬HPS的感染情況

2.3 秋、冬季節HPS的感染情況 由表3可知，各豬場冬季HPS感染情況較嚴重，陽性檢出率在24.1%～31.4%之間，極顯著高于秋季的6.7%～18.7%（P＜0.01）。

表3 秋、冬季節HPS的感染情況

3 討論

目前，檢測HPS的方法很多，PCR技術是進行病原檢測的常用方法，用血清學方法檢測抗體有利于大規模的普查和快速診斷。間接ELISA方法是血清學檢測方法中較為敏感、特異的方法，比間接血凝試驗更準確、敏感、客觀［3－4］。選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA檢測方法的關鍵，國內石碧等［5］、王艷等［6］選用莢膜多糖、全菌體作為包被抗原分別建立了檢測HPS抗體的間接ELISA方法，均取得了較好的試驗結果，可用于診斷和流行病學調查。經超聲裂解的細菌菌液上清中含有大量菌體可溶性蛋白和多糖抗原，常作為各種血清學診斷方法所用的抗原，具有制備方法簡單、易于控制質量、廣譜和敏感性高的特點，國內魏子貢等［7］用HPS超聲裂解抗原致敏紅細胞，建立了HPS抗體間接血凝檢測方法，具有敏感性高、特異性強、重復性好等特點，可用于疫苗免疫后抗體水平的檢測及副豬嗜血桿菌的流行病學調查。國內尚未見用超聲裂解抗原建立檢測HPS抗體的間接ELISA方法的報道。因此，本次調查選用HPS間接ELISA抗體檢測方法是以超聲裂解副豬嗜血桿菌外膜蛋白（OMP）P2作為包被抗原，通過條件優化的新方法。在廣東增城、從化、鶴山等地區部分豬場開展HPS的流行病學調查，初步了解廣東省部分地區的副豬嗜血桿菌的流行情況。

調查結果表明，廣東增城、從化、廣州地區的豬存在不同程度的場HPS感染，但不同豬場的HPS抗體陽性檢出率相差很大，平均感染率為23.8%。其中增城豬場的陽性檢出率最高（30.9%），從化豬場次之（21.3%），鶴山區豬場最低（13.7%）。造成這種情況的原因是各個豬場不同的飼養管理條件。比如，場內的動物防疫工作不是很嚴謹，沒有嚴格按照規范的消毒、免疫程序制定相應的日常消毒和疾病防疫制度；豬場普遍選址不是很理想，有的豬場比較靠近高速公路，有的比較接近村莊。一般豬場的衛生管理都不太理想，存在一些不合理因素，比如豬場建設不合理，空氣污染嚴重、通風不良，豬場的管理人員并不是專業的獸醫人員，缺乏對豬及豬場的專業知識的了解，所以要控制該病，必須要加強飼料管理和豬的保健工作，搞好豬場環境衛生，使豬的生長環境比如溫度，通風，空氣等都保持在良好狀態，及時定期做好豬群疫病的監測工作。

不同日齡階段的豬感染情況也不同，其中母豬陽性率高達34.5%；保育仔豬和育肥豬陽性檢出率較高，分別為46.1%和30.8%。母豬抗體陽性率和抗體水平較高，但母豬的臨床病例并不多見，這種現象在規模化豬場非常普遍，其根本原因是母豬對副豬嗜血桿菌有較強抵抗力。哺乳仔豬的抗體陽性率較低且和母豬的結果有一定程度的接近，主要是哺乳仔豬受母源抗體影響較大。目前，關于導致副豬嗜血桿菌病流行加強的因素仍不清楚。不過，早期斷奶以及三點飼養系統的應用可能對副豬嗜血桿菌病在豬場內的流行具有影響，尤其是對于副豬嗜血桿菌有毒力菌株在豬體內的早期定居以及這些菌株在整個豬場的流行而言。對副豬嗜血桿菌全身感染所致保育豬死亡的控制有賴于準確的診斷以及對發病豬場內傳染的流行病學研究［8－9］。盡管HPS的致病機理尚不十分清楚，但美國明尼蘇達大學Pijoan and Oliveira等認為［10］，當前Glasserps病的暴發流行與仔豬早期斷奶及豬感染豬繁殖與呼吸綜合征關系密切，即HPS在仔豬保育期死亡中的作用可分為原發性病原體和繼發性病原體。將副豬嗜血桿菌徹底清除出豬群的方法并不現實，因為副豬嗜血桿菌本來就是上呼吸道的常在菌，1周齡前的仔豬鼻黏膜就可能有副豬嗜血桿菌的定居，所以通過早期斷奶來根除該菌是不可能的。在斷奶后很早就發病的豬群，可以對仔豬進行給藥時和斷奶時免疫接種［11］，在死亡高峰出現較晚時（進入保育舍4～6周）的豬群，則在仔豬斷奶時和斷奶后兩周進行免疫。

了解特定豬場中病原的流行病學，是防制受害豬群中副豬嗜血桿菌病的關鍵。冬季的寒冷天氣是HPS感染的主要誘因，容易發生副豬嗜血桿菌病的流行。本次的調查結果印證了這一點。

本次的調查結果和李春玲等2008年的調查結果基本一致［12］，進一步說明了副豬嗜血桿菌在廣東豬場的感染的普遍性和季節性。也間接說明了本次所用的針對副豬嗜血桿菌外膜蛋白P2（OMP P2）的間接ELISA法的準確性和敏感性可用于HPS的快速診斷。

［1］王興美，鄧銜柏，李玉谷，等.副豬嗜血桿菌病的研究進展［J］.豬業科學，2007，12：21－22.

［2］張煥容.副豬嗜血桿菌抗原性研究進展［J］.動物醫學進展，2010，31（7）：91－94.

［3］張盼鋒，仇微，劉宇，等.副豬嗜血桿菌PCR快速診斷方法的建立［J］.廣東畜牧獸醫科技，2009，34（1）：33.

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［5］石碧，崔耀文，賈凡，等，副豬嗜血桿菌血清5型間接血凝試驗和間接ELISA抗體檢測方法的建立［J］.中國獸醫科學，2007，37（11）：964－968.

［6］王艷，夏萬田，姜平，等.副豬嗜血桿菌間接ELISA抗體檢測方法的建立［J］.畜牧與獸醫，2006，38（3）：5－6.

［7］魏子貢，蔡旭旺，金梅林，等.副豬嗜血桿菌抗體間接血凝檢測方法的建立及應用［J］.中國獸醫科學，2006，36（9）：713－718.

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［11］尹秀鳳，王艷，姜平，等.我國部分地區副豬嗜血桿菌病的流行病學調查［J］.畜牧與獸醫，2007，39（6）：13.

［12］李春玲，賈愛卿，王貴平，等.廣東地區豬群中副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌的檢測與分析［C］.首屆中國獸藥大會－獸醫生物制品學、獸醫微生物學學術論壇論文集（2008），天津：2008.