牛新孢子蟲內(nèi)標(biāo)多重PCR檢測方法的試驗

唐慧芬，季新成，于學(xué)輝

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.新疆出入境檢驗檢疫局，新疆 烏魯木齊830063）

新孢子蟲病（Neosporasis）是犬新孢子蟲（Neosporacaninum，N.caninum）寄生于宿主體內(nèi)引起的一種機會性原蟲病，牛、羊、馬、鹿等均可作為中間宿主，終末宿主是犬，雖然該病可引起多種家畜共患，但對牛的危害更大，主要造成懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生兒的運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該病呈世界性分布，給畜牧業(yè)造成了嚴重的危害［1－2］，我國也有該病發(fā)生的報道［3］。迄今為止，還沒有防治新孢子蟲病的有效藥物和疫苗，高效快速的檢測方法對于該病的防控至關(guān)重要。PCR方法具有快速、靈敏、高效等優(yōu)點，已有很多采用該方法檢測此病的報道［2，4］，但都是針對單個基因的檢測，且沒有對反應(yīng)體系進行質(zhì)量監(jiān)控。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進并發(fā)展起來的一種技術(shù)，在一個反應(yīng)管中使用多對引物，實現(xiàn)對多個基因的同步檢測［5］，克服了單基因檢測可能造成漏檢的弊端。本試驗以牛新孢子蟲基因組中保守的NcSAG1基因、Nc－5基因和NcSRS2基因同時作為檢測的目的基因，并以牛性腺基因（prolactin）作為內(nèi)標(biāo)，在實現(xiàn)多基因檢測的同時，通過內(nèi)標(biāo)引物對反應(yīng)體系進行監(jiān)測，為牛新孢子蟲病的快速檢測提供更為準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 陽性核酸、樣品及相關(guān)對照 犬新孢子蟲陽性核酸，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院劉群教授惠贈；牛抗凝全血和流產(chǎn)胎兒組織等樣品，采自新疆不同牛場；牛皰疹病毒I型等病原陽性核酸，由新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心實驗室保存。

1.2 主要試劑TaqDNA 聚合酶（5U／μL）、DL－2 000DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ等，購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、全血基因組DNA提取試劑盒和DNA zol，購自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司；PGM－T載體，購自天根生化科技（北京）有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NcSAG1基因、NC－5基因和NcSRS2基因以及prolactin基因，各設(shè)計一對特異性引物，擴增的目的片段長度分別為201 bp、231bp、256bp和156bp。基因名稱及引物序列見表1。

表1 基因名稱及引物序列

1.4 模板DNA的制備 抗凝全血按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作；流產(chǎn)胎兒組織先經(jīng)液氮研磨，然后按照DNA zol基因組DNA快速提取試劑盒說明書進行操作。DNA溶于50 μL TE溶液中，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單重PCR反應(yīng)的優(yōu)化 采用25μL反應(yīng)體系：dNTP 終濃度分別為 1.0，1.5，2.0 和 2.5 mmol／L，引物終濃度分別為0.2，0.4，0.6和0.8 μmol／L，Mg2＋終濃度分別為1.0，1.5，2.0和2.5 mmol／L，TaqDNA 聚合酶終濃度分別為 0.75，1.0，1.25和1.5U，退火溫度分別為56℃，58℃和61℃，循環(huán)參數(shù)分別為30，35和40，優(yōu)化一項時其他參數(shù)不變。收集PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.6 單重PCR擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定 將目的基因用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，與PGM－T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，制備陽性重組質(zhì)粒。

1.7 單重PCR靈敏度試驗 將陽性重組質(zhì)粒的濃度進行10倍梯度稀釋，以1010、109、108、107、106、105、104、103、102、101copies／μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。取109～101copies／μL按1.5優(yōu)化出的最佳條件進行擴增，以驗證本方法的靈敏度。

1.8 多重PCR反應(yīng)的優(yōu)化 在單重PCR最佳反應(yīng)條件的前提下，于一個反應(yīng)管中用4對引物同時進行PCR擴增，同1.5進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，收集PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.9 多重PCR反應(yīng)的特異性 分別對牛皰疹病毒I型等核酸進行多重PCR擴增。每次擴增反應(yīng)同時，設(shè)雙蒸水作陰性對照和牛新孢子蟲與牛基因組混合物作陽性對照，以檢測方法的特異性。

1.10 多重PCR共擴增反應(yīng)的靈敏度檢測 將等量的內(nèi)標(biāo)基因與目的基因同步10倍梯度稀釋后作為模板加入反應(yīng)體系，檢測共擴增對反應(yīng)靈敏度。

1.11 內(nèi)標(biāo)模板對多重PCR反應(yīng)靈敏度的影響固定Prolactin重組質(zhì)粒濃度為109copies／反應(yīng)不變，與各系列梯度稀釋的目的基因進行共擴增，驗證高濃度內(nèi)標(biāo)基因的存在是否會影響目的基因擴增的靈敏度。

1.12 重復(fù)性試驗 以新孢子蟲全基因組為模板，用優(yōu)化好的多重PCR方法進行3次重復(fù)檢測，以驗證其穩(wěn)定性。

1.13 臨床樣品的檢測 應(yīng)用所建立的多重PCR方法對采自新疆不同牛場的樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR反應(yīng)及優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的單重PCR反應(yīng)體系為：dNTP終濃度1.5mmol／L，引物終濃度0.4μmol／L，Mg2＋終濃度1.5mmol／L，TaqDNA聚合酶終濃度1.0IU，反應(yīng)體積為25μL；擴增條件為：95℃，5min；95℃，30s，58℃，20s，72℃30s，30個循環(huán)；最后經(jīng)72℃延伸10min。擴增出大小為156bp、201bp、231bp和256bp的電泳條帶，與目的片段相符，見圖1。

圖1 各引物PCR擴增結(jié)果

2.2 單重PCR靈敏度試驗 用優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對10倍梯度稀釋的4種重組質(zhì)粒（109～101copies／μL）進行擴增，最低檢測限均為102copies／反應(yīng)，以NcSRS2重組質(zhì)粒的靈敏度為例，見圖2。

圖2 NcSRS2靈敏度試驗結(jié)果

2.3 多重PCR反應(yīng)及優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系為：dNTP終濃度2.0mmol／L，引物的終濃度為0.6μmol／L，Mg2＋終濃度2.0mmol／L，TaqDNA聚合酶終濃度1.25U，反應(yīng)體積為25μL；擴增條件為：95，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃1min，35個循環(huán)；最后經(jīng)72℃延伸10min。在同一反應(yīng)管中分別擴增出大小為156bp、201bp、231bp和256 bp的電泳條帶，與目的片段相符，見圖3。

2.4 多重PCR特異性試驗 應(yīng)用多重PCR方法對各核酸進行擴增，結(jié)果只在prolactin與犬新孢子蟲核酸混合物中擴增出大小為156bp、201bp、231 bp和256bp的特異性條帶，而其他樣品均未出現(xiàn)擴增條帶，說明該方法具有較強的特異性，見圖4。

2.5 多重PCR共擴增靈敏度試驗 將等量的4種重組質(zhì)粒按10倍梯度稀釋混合后作為模板，采用多重PCR方法進行共擴增，結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度均為103copies／反應(yīng)時，各基因均可擴增出目的條帶，說明各基因間沒有產(chǎn)生明顯的抑制，見圖5。

2.6 內(nèi)標(biāo)對多重PCR反應(yīng)靈敏度的影響 固定Prolactin重組質(zhì)粒的濃度為109copies／反應(yīng)，分別與10倍梯度稀釋的3種目的基因的重組質(zhì)粒（109～101copies／反應(yīng)）的混合物共同作為模板，采用多重PCR方法進行擴增，對各目的基因的檢測靈敏度仍為103copies／反應(yīng)，說明內(nèi)標(biāo)基因存在對目的基因的擴增影響較小，見圖6。

圖6 多重PCR檢測靈敏度

2.7 重復(fù)性試驗 用所建立的多重PCR方法，以牛新孢子蟲全基因組為模板進行3次重復(fù)檢測，均可擴增出特異片段，圖略。

2.8 臨床樣品檢測 利用所建立的多重PCR方法對來自新疆不同牛場的50份流產(chǎn)牛全血和8份流產(chǎn)胎兒樣品進行檢測。結(jié)果顯示，3份流產(chǎn)牛全血和1份流產(chǎn)胎兒樣品呈陽性。

3 討論

NcSAG1基因是編碼新孢子蟲主要表面抗原蛋白NcSAG1的基因，存在于速殖子中，與弓形蟲上的同位基因同源性很低［6］；NcSRS2基因是犬新孢子蟲一種重要功能基因，在剛地弓形蟲基因組中不存在［7］，其編碼的NcSRS2蛋白存在于致密顆粒棒狀體內(nèi)以及速殖子表面；而重復(fù)序列Nc－5基因僅存在于犬新孢子蟲基因組中［8］。將3個不同基因作為目的片段，只要出現(xiàn)其中任1個至3個目的條帶即可判斷為陽性，避免了因某一種基因發(fā)生變異導(dǎo)致的單重PCR檢測出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，增加了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

研究表明，臨床樣品中含有的大量復(fù)雜未知成分和核酸抽提過程中殘留的試劑可能抑制PCR擴增，包括提取過程中核酸的丟失，這些情況都會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本試驗以牛病為研究對象，故將牛性腺基因引入作為內(nèi)標(biāo)，同步參與核酸提取和反應(yīng)擴增，可對整個檢測過程進行質(zhì)量監(jiān)控。為了避免檢測過程中基因組DNA片段的降解，內(nèi)標(biāo)基因常選擇較短的目的序列。只有在內(nèi)標(biāo)基因正常擴增的前提下，出現(xiàn)3個目的基因中的任何1種到3種，結(jié)果均真實可靠。若沒有任何擴增條帶，說明核酸可能丟失或含有PCR抑制物質(zhì)。

多重PCR的影響因子比較復(fù)雜［9］，當(dāng)在同一反應(yīng)體系中存在多對引物時，PCR的靈敏度會降低［10］，這可能與多對引物間更容易形成二聚體有關(guān)，故引物的設(shè)計是關(guān)鍵。本試驗設(shè)計的每條引物之間幾乎不存在交叉反應(yīng)，且退火溫度比較相近，保證了在相同條件下目的片段都能得到有效擴增，4種目的片段之間至少相差20bp，能夠在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測中明顯區(qū)分。多重PCR各引物間的相對濃度也會影響擴增效果，很多研究都對此進行了優(yōu)化［11］。但實際檢測過程中，樣品里各模板含量是未知的，即如果某種模板含量高，則擴增條帶相對較亮，反之則較弱，調(diào)整引物間相對終濃度對于臨床檢測意義不大。更重要的是，如果固定了每對引物間的相對終濃度，那么每當(dāng)有新的引物加入時都要重新對其進行大量的優(yōu)化。本試驗把所有引物看成一個整體，通過將退火時間延長至30s、延伸時間延長至1min，并對 Mg2＋濃度、dNTP濃度等在單重PCR基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，最終在每對引物按等濃度加入時，各目的基因均能達到一致的擴增效果，且操作更為簡便，這可能與延長退火時間可以增加引物與模板結(jié)合的機會有關(guān)。考慮到臨床應(yīng)用中，牛性腺基因存在的穩(wěn)定性和被檢目的基因的不確定性，本試驗將較高濃度的內(nèi)標(biāo)基因與系列稀釋的目的基因進行共擴增，未見對靈敏度產(chǎn)生明顯影響。

本試驗所建立的牛新孢子蟲病多重PCR檢測方法的靈敏度與單重PCR相比，只低了10倍，且具有較好的特異性和可重復(fù)性，既能對反應(yīng)過程進行質(zhì)量控制，又能達到快速、準(zhǔn)確檢測的目的。

［1］徐曉芳，邢沈陽，李建華，等.新孢子蟲病檢測方法研究進展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2011，6（4）：311－314.

［2］岳韜，秦建華.奶牛新孢子蟲病PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（4）：386－389.

［3］王常漢，季新成，楊帆，等.新疆地區(qū)流產(chǎn)奶牛新孢子蟲病和布氏桿菌病的流行學(xué)調(diào)查［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，3：657－660.

［4］蔡錦順，魯承，王彥方，等.牛新孢子蟲病PCR檢測方法的建立和應(yīng)用［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2007，29（4）：312－315.

［5］陶生策，張治平，張先恩.PCR技術(shù)研究進展［J］.生物工程進展，2001，21（4）：26－29.

［6］金超，賈立軍，曹世諾，等.牛新孢子蟲病LAMP檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（12）：1084－1088.

［7］翟延慶，李利，王春仁.新孢子蟲NcSRS2基因的克隆和亞克隆［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，4：68－69.

［8］Andreas L，Chryssafidis，Rodrigo M，etal.Evidence of congenital transmission of Neospora caninum in naturally infected water buffalo（Bubalus bubalis）fetus from Brazil［J］.Parasitology Research，2011，108（3）：741－743.

［9］劉志杰，李儒舉，曾智勇，等.多重PCR反應(yīng)的影響因素及其優(yōu)化［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，7：26－28.

［10］Jeyasekaran G，Raj K T，Shakila R J，etal.Multiplex polymerase chain reaction－based assay for the specific detection of toxin－producing Vibrio cholerae in fish and fishery products［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2011，90（3）：1111－1118.

［11］孫黎，郭抗抗，王靜，等.豬細小病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（8）：25－31.