檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體的兩種ELISA方法的比較及其應用

吳雪軍，周彩琴，趙靈燕，陳星宇，吳赟竑，王燕萍，張傳亮，姜中其，徐 輝

（1.浙江省動物疫病預防控制中心，浙江 杭州310020；2.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州310029）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS），是一種由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的、以母豬繁殖障礙及仔豬和育肥豬呼吸道疾病為特征的急性病毒性傳染病，不同年齡、品種和性別的豬均能感染，臨床主要特征為流產，產死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困難。PRRS在全世界各主要養豬國家均有發生，近年來我國也有多個省份的養豬場、農戶暴發疫情，給我國的養豬業造成了巨大的經濟損失。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）具有操作簡便、易于標準化、快速敏感等優點，非常適合進行大規模流行病學調查和監測［3］。目前，針對PRRSV的不同抗原有兩種檢測PRRSV抗體的ELISA方法：G－ELISA方法采用膜蛋白（M 蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）作為包被抗原；N－ELISA方法以核衣殼蛋白（N蛋白）作為主要包被抗原。本試驗擬通過對這兩種間接ELISA方法進行比較，分析其在免疫監測和臨床檢測中的特點，為應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 N蛋白抗體檢測ELISA（N－ELISA）試劑盒由美國IDEXX公司生產（Herd－Check＊PRRS X3），批號：40959－V931；膜蛋白抗體ELISA（G－ELISA）試劑盒由法國LSI公司生產（LSI TEST SUIS PRRS），批號：5－VETPRA－004。

1.2 檢測樣品 根據試驗設計從浙江省內的10個規模豬場采集豬血清共216份，其中仔豬70份，生長豬30份，后備種豬40份，育肥豬76份，－20℃保存備用。

1.3 檢測方法及結果判定 PRRSV抗體檢測方法均按照試劑盒說明書進行。N－ELISA方法以（S／N）值判定結果，其中S／N≥0.40為PRRS抗體陽性，S／N＜0.40為PRRS抗體陰性；G－ELISA 方法以IRPC值判定結果，其中IRPC≤20.0為抗體陰性，IRPC＞20.0為抗體陽性。為方便兩種ELISA方法檢測結果比較分析，將IRPC值標準化，即將IRPC轉換成IRPC／100，與S／P值一致。

1.4 檢測數據處理分析 通過計算相關系數、符合率、Kappa值等統計學和流行病學指標，綜合評價試驗結果。

2 結果與分析

2.1 兩種檢測方法結果一致性的分析 采用兩種檢測方法同時檢測10個豬群216份血清，并按試劑盒給定的臨界點來判斷結果的陰陽性，具體結果見表1。

結果表明，兩種ELISA方法在檢測PRRS血清抗體時，陽性率差異不顯著（P＞0.05），符合率達到92.6%，Kappa值為0.74，表明兩種ELISA檢測方法在按試劑盒提供的陰陽性臨界點進行結果定性判斷并統計抗體陽性率時，具有良好的一致性（表1、圖1）。但是，兩種檢測方法所得到的PRRS抗體水平效價差異明顯，相關系數也僅為0.651，見圖2。

2.2 設定不同陰陽性臨界點時兩種檢測方法的陽性率變化 以全部216份豬血清樣品作為一個整體，將G－ELISA方法所得結果IRPC值轉換成IRPC／100后，通過調整兩種ELISA方法的陰陽性臨界點比較檢測相同樣品時的豬群PRRS抗體陽性率的變化趨勢，如圖3結果所示，兩種檢測方法在同時調整陰陽性臨界點時，總體變化趨勢基本一致，應用統計學方法建立的方程分別為：y＝－1.504 9x＋86.694和y＝－4.210 3x＋84.26，斜率為－1.504 9和－4.210 3，G－ELISA方法的陽性率變化幅度更大，統計學上呈顯著差異。

為進一步分析陰陽性臨界點變化對兩種ELISA方法陽性率檢測結果的影響，以A、B、C、D四個豬群作為研究對象，調整陰陽性判定的臨界點，分析在不同免疫狀況下，兩種檢測方法所得出的陽性率變化情況，具體結果見圖4、5。

由圖4、圖5可知，當臨界點逐漸提高以后，用兩種檢測方法所得的陽性率逐漸降低，且對不同的免疫背景豬群陽性率變化總體趨勢均沒有顯著的影響。但兩者的下降幅度有所不同，N－ELISA檢測方法對PRRS弱毒苗免疫后30d豬群陽性率明顯高于G－ELISA；而PRRS弱毒苗免疫后107d豬群陽性率檢測結果表明，G－ELISA的高抗體水平維持時間比N－ELISA長。

3 分析與討論

一直以來，國內通常以N－ELISA（美國IDEXX公司生產）作為PRRSV抗體檢測的“金標準”，該方法敏感、特異、快速，適合于PRRS的早期預警。但由于N蛋白不能誘導產生病毒中和抗體，應用中常被認為以N蛋白作為包被抗原的試劑無法反應機體的免疫狀態，不適合用于對疫苗免疫效果監測。G－ELISA以膜蛋白（包括 M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）。其中 GP5蛋白是一種主要的結構蛋白，對于受體識別具有一定的作用。由于N端的外側結構域含有一個主要的中和抗體決定簇，這就證實了GP5結構在病毒的侵染過程中起著一定的作用［1～3］。由于膜蛋白為PRRSV主要表面抗原，在病毒傳播和機體免疫中起關鍵作用，因此普遍認為采用膜蛋白作為包被抗原的ELISA診斷方法不僅能檢測野毒感染狀況，而且能解決N蛋白作為抗原的診斷方法無法反映機體免疫狀況的缺陷，有利于疫苗抗體水平的檢測，為豬場進行疫苗免疫效果評估提供重要的技術手段，所以這種方法在評估疫苗的免疫效果中更為準確可靠。

研究結果表明，G－ELISA與N－ELISA兩種檢測方法陽性率結果差異并不顯著，具有很高的符合率和一致性。因此，通過數據標準化，調整陰陽性判定的臨界點，兩種方法在一定程度上互相代替是可行的。由于兩種方法包被的抗原不同，N－ELISA方法測出的陽性率和效價均比G－ELISA要高，這也與N蛋白在病毒粒子中表達量較高相吻合，同時這也可能造成了一定比例的假陽性。當采用N－ELISA方法做免疫效果評估時，若發現與免疫保護效果相關性差距較大時，應考慮選用G－ELISA方法，并適當調整陰陽性判定的臨界點，使得與實際情況更符合。

在對陰性豬場進行PRRSV抗體監測時，可考慮采用N－ELISA方法，以便能夠較早的發現病毒感染，為防疫爭取更多的時間；臨床穩定且用PRRS疫苗免疫的豬場建議采用N－ELISA方法，并可以通過調整陰陽性臨界點，使結果更接近G－ELISA和豬群的實際情況；對于臨床不穩定的豬場，應當采用G－ELISA方法進行抗體檢測，以準確反應豬群的整體免疫狀況，但建議對現有的陰陽性臨界點進行調整，因為根據現有商品化試劑盒提供的N－ELISA和G－ELISA判定依據獲得的群體抗體陽性率并未表現出顯著差異，也無法以更好的體現出G－ELISA方法的特點。

［1］杜文金，劉衛，王志亮，等.應用重組豬生殖與呼吸綜合征病毒核衣殼蛋白為抗原建立ELISA檢測方法的研究［J］.中國獸醫科技，2000，30（6）：7－9.

［2］Ferrin N H，Fang Y，Johnson C R，etal.Validation of a blocking enzyme－linked immunosorbent assay for detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2004，11：503－514.

［3］Seuberlich T，Tratschin J D，Thur B，etal.Nucleocapsid proteinbased enzyme－linked immunosorbent assay for detection and differentiation of antibodies against European and North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9：1183－1191.