1株鴨源性都柏林沙門菌的分離與鑒定

邵慧君，孫化露，吳 白，王彥紅，劉文博

（揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州225009）

沙門菌是腸桿菌科中一個重要的菌屬，可感染人和動物，且大部分具有很強的致病性，在醫學、獸醫和公共衛生上均十分重要。目前，該菌屬具有2 500多個血清型［1］，而我國報道的血清型有287個血清型，分為37個群［2］，其中對人畜危害的有30余種。沙門菌也是水體污染的主要病原菌之一，對于水產養殖、水禽養殖是一個潛在的危害。其中，即屬于D群沙門菌，又在沙門菌屬中侵襲力最強的動物源性病原菌的都柏林沙門菌，是牛羊的強適應性菌型，多在各自宿主中致病，但也能感染其他動物，可造成人類血行感染，導致敗血癥［3］。人類感染1979年在丹麥首例報道，以后世界各地陸續發現［3－5］。本試驗從麻鴨的肝臟分離到一株都柏林沙門菌，并對其生物學特性進行了相關研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 LB培養基、麥康凱瓊脂培養基，按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉，購自上海中科昆蟲生物技術開發有限公司，瓊脂粉與氯化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司，蛋白胨與胰酶，購自OXOID公司；腸桿菌科細菌生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清，購自中國生物技術集團公司蘭州生物制品研究所；16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，購自TaKaRa公司；藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細菌分離 2011年5月，揚州某養殖戶飼養的500只13日齡麻鴨，病程7～8d，共有200只死亡。剖檢病變為心包炎、氣囊炎、肝周炎。取送檢麻鴨的肝組織無菌接種LB培養基、麥康凱瓊脂培養基，37℃倒置培養24～48h后，觀察結果。取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，觀察細菌形態及染色特性。1.3 生化試驗 取純化的菌株接種于腸桿菌科細菌生化管，37℃溫箱中培養24～48h。記錄生化反應結果，再對照《獸醫微生物學》中關于腸桿菌科生化特性的內容［6］。

1.4 血清學試驗 玻片凝集反應：取潔凈的玻片，加少量沙門菌診斷血清，再用滅菌的接種環挑取純化的單個菌落，并與血清充分混勻。2min內觀察是否有凝集現象出現。

1.5 16SrDNA基因序列分析 采用煮沸裂解法制備細菌基因組DNA模板，取400μL過夜培養的菌液12 000r／min離心10min，沉淀用100μL滅菌超純水重懸，100℃水浴10min，置于冰上10 min，12 000r／min離心10min，取上清作為PCR模板；根據16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit說明進行PCR擴增，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收純化陽性條帶，克隆至pGEM－T Easy載體，鑒定的陽性質粒送南京金斯特科技有限公司進行測序；將測定的序列在NCBI網站進行BLAST搜索比對，鑒定細菌種屬。

1.6 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法，藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司，操作方法和判定標準參照該公司操作方法與標準。藥敏紙片有：菌必治（30μg／片）、氟哌酸（10μg／片）、氯霉素（30 μg／片）、卡那霉素（30μg／片）、左氟沙星（5μg／片）、丁胺卡那霉素（30μg／片）、慶大霉素（10μg／片）、萘啶酸（30μg／片）、鏈霉素（10μg／片）、復方新諾明（23.75μg／片）、多黏菌素B（300U／片）、痢特靈（300μg／片）、羅美沙星（10μg／片）、美洛西林（75 μg／片）、強力霉素（30μg／片）。

2 結果

2.1 細菌分離 從送檢麻鴨的肝組織分離的細菌，在LB板上長出乳白色、圓潤菌落，在麥康凱瓊脂上培養48h后可見無色、透明的菌落，生長緩慢。無菌采取麥康凱純化的單個透明菌落，革蘭染色后，鏡檢可見革蘭陰性桿菌。

2.2 生化試驗 該分離菌株對大多數糖類產酸產氣，不能發酵尿素、側金盞花醇、枸櫞酸鹽、苯丙氨酸、靛基質、V－P、蔗糖、阿拉伯糖，此結果符合都柏林沙門菌的生化特性。生化結果見表1。

2.3 血清型 其血清型與都柏林沙門菌的抗原模式相一致，初步判定該分離株為都柏林沙門菌。血清型鑒定試驗結果如表2。

表1 生化試驗結果

表2 血清學試驗

2.4 藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示，分離菌株對菌必治、氟哌酸、氯霉素、卡那霉素、左氟沙星、丁胺卡那霉素、慶大霉素7種藥物敏感；而對萘啶酸、鏈霉素、復方新諾明、多粘菌素B、痢特靈、羅美沙星、美洛西林、強力霉素8種藥物耐藥。

2.5 16SrDNA基因序列分析 用16SrDNA試劑盒擴增分離菌的16SrDNA片段后瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察，在600bp左右有1條特異條帶（圖1）；克隆至T載體后以EocRⅠ酶切，可見1條3 000bp的載體片段和1條600bp的目的條帶（圖2）。陽性質粒經南京金斯特科技有限公司測序；將測定的序列在NCBI網站進行BLAST搜索比對，結果為都柏林沙門菌。

3 討論

3.1 禽類，特別是幼禽感染禽副傷寒沙門菌多呈急性或亞急性癥狀，其臨床癥狀和剖檢病變并不具有特征性的診斷意義［5］。本次病例中感染家禽的臨床診斷與病例剖檢為心包炎、氣囊炎、肝周炎的病理變化，易被誤診為單方面由大腸桿菌感染引起該病。根據本試驗中分離菌株的培養特性、形態結構、生化特性可初步鑒定為腸桿菌科、沙門菌屬，再通過該菌株的血清型及16SrDNA基因序列分析的結果均符合都柏林沙門菌的生物學特性，故可判定本試驗中分離株為都柏林沙門菌。由于細菌菌株的16S rRNA基因分子結構上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使16SrRNA基因成為了公認的細菌分類指標［6］，因而將測定細菌的16S rRNA基因進行序列分析，運用于細菌的鑒定。現今16SrDNA序列分析是目前較好的快速而直接的檢測微生物的分子生物學技術的方法之一，已經被廣泛使用［7］。雖然現今有些沙門菌的抗原模式發生變異對鑒定結果有影響，但通過16SrDNA基因序列分析保證了鑒定結果的準確性，從而能對此次病例的診斷做出正確的判定。

3.2 都柏林沙門菌的自然宿主是牛、羊［8］，并且是一種潛在的人畜共患病。國內外均有報道，都柏林沙門菌除了造成牛、羊流產、死亡外，還會引起人源性的食物中毒［3，9－11］。通過調查分析，國外專家認為，未經巴氏消毒的牛奶、奶制品和牛肉及牛肝臟是都柏林沙門菌的主要感染源［8－9］。國內曾報道過，因食用被都柏林沙門污染的食品而引起的食物中毒，其通常引起人惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發熱等主要癥狀，并且能從被污染的食物和人的血液或糞便大多能分離到該病原菌［3，10－12］。因此，人感染都柏林沙門菌引起的食物中毒，大都是由于食用食物周圍環境不良引起沙門菌的污染，而從禽類分離到的都柏林沙門菌也可能是由于周圍的飼養環境管理不善所引起的［3］。若這種被污染的禽類肉制品沒有被及時處理掉，而流入市場，仍會引起人的食物中毒。2011年，馬來西亞曾報道過病鴨是食源性沙門菌感染的重要感染源［13］。因此，有關部門對肉制品的檢驗檢測中，應嚴格執行《食品衛生法》，以防控食源性食物中毒的發生。當然，養殖戶也應做到規范養殖，對養殖水域進行有效的消毒措施，加強水禽常見疾病的常規防制，提高禽類的免疫力，做好從源頭對病原防控。

3.3 藥敏試驗結果表明，分離菌株對多種藥物耐藥，同時也對多種藥物敏感，建議該養殖戶使用氟哌酸治療。

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