1株鴨源性都柏林沙門菌的分離與鑒定

邵慧君，孫化露，吳 白，王彥紅，劉文博

（揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州225009）

沙門菌是腸桿菌科中一個重要的菌屬，可感染人和動物，且大部分具有很強的致病性，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上均十分重要。目前，該菌屬具有2 500多個血清型［1］，而我國報道的血清型有287個血清型，分為37個群［2］，其中對人畜危害的有30余種。沙門菌也是水體污染的主要病原菌之一，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖、水禽養(yǎng)殖是一個潛在的危害。其中，即屬于D群沙門菌，又在沙門菌屬中侵襲力最強的動物源性病原菌的都柏林沙門菌，是牛羊的強適應(yīng)性菌型，多在各自宿主中致病，但也能感染其他動物，可造成人類血行感染，導(dǎo)致敗血癥［3］。人類感染1979年在丹麥?zhǔn)桌龍蟮溃院笫澜绺鞯仃懤m(xù)發(fā)現(xiàn)［3－5］。本試驗從麻鴨的肝臟分離到一株都柏林沙門菌，并對其生物學(xué)特性進行了相關(guān)研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉，購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司，瓊脂粉與氯化鈉，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，蛋白胨與胰酶，購自O(shè)XOID公司；腸桿菌科細(xì)菌生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清，購自中國生物技術(shù)集團公司蘭州生物制品研究所；16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，購自TaKaRa公司；藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離 2011年5月，揚州某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)的500只13日齡麻鴨，病程7～8d，共有200只死亡。剖檢病變?yōu)樾陌住饽已住⒏沃苎住Ｈ∷蜋z麻鴨的肝組織無菌接種LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)24～48h后，觀察結(jié)果。取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。1.3 生化試驗 取純化的菌株接種于腸桿菌科細(xì)菌生化管，37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h。記錄生化反應(yīng)結(jié)果，再對照《獸醫(yī)微生物學(xué)》中關(guān)于腸桿菌科生化特性的內(nèi)容［6］。

1.4 血清學(xué)試驗 玻片凝集反應(yīng)：取潔凈的玻片，加少量沙門菌診斷血清，再用滅菌的接種環(huán)挑取純化的單個菌落，并與血清充分混勻。2min內(nèi)觀察是否有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)。

1.5 16SrDNA基因序列分析 采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板，取400μL過夜培養(yǎng)的菌液12 000r／min離心10min，沉淀用100μL滅菌超純水重懸，100℃水浴10min，置于冰上10 min，12 000r／min離心10min，取上清作為PCR模板；根據(jù)16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit說明進行PCR擴增，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收純化陽性條帶，克隆至pGEM－T Easy載體，鑒定的陽性質(zhì)粒送南京金斯特科技有限公司進行測序；將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST搜索比對，鑒定細(xì)菌種屬。

1.6 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法，藥敏試紙，購自杭州天和微生物試劑有限公司，操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參照該公司操作方法與標(biāo)準(zhǔn)。藥敏紙片有：菌必治（30μg／片）、氟哌酸（10μg／片）、氯霉素（30 μg／片）、卡那霉素（30μg／片）、左氟沙星（5μg／片）、丁胺卡那霉素（30μg／片）、慶大霉素（10μg／片）、萘啶酸（30μg／片）、鏈霉素（10μg／片）、復(fù)方新諾明（23.75μg／片）、多黏菌素B（300U／片）、痢特靈（300μg／片）、羅美沙星（10μg／片）、美洛西林（75 μg／片）、強力霉素（30μg／片）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 從送檢麻鴨的肝組織分離的細(xì)菌，在LB板上長出乳白色、圓潤菌落，在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)48h后可見無色、透明的菌落，生長緩慢。無菌采取麥康凱純化的單個透明菌落，革蘭染色后，鏡檢可見革蘭陰性桿菌。

2.2 生化試驗 該分離菌株對大多數(shù)糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能發(fā)酵尿素、側(cè)金盞花醇、枸櫞酸鹽、苯丙氨酸、靛基質(zhì)、V－P、蔗糖、阿拉伯糖，此結(jié)果符合都柏林沙門菌的生化特性。生化結(jié)果見表1。

2.3 血清型 其血清型與都柏林沙門菌的抗原模式相一致，初步判定該分離株為都柏林沙門菌。血清型鑒定試驗結(jié)果如表2。

表1 生化試驗結(jié)果

表2 血清學(xué)試驗

2.4 藥敏試驗 藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株對菌必治、氟哌酸、氯霉素、卡那霉素、左氟沙星、丁胺卡那霉素、慶大霉素7種藥物敏感；而對萘啶酸、鏈霉素、復(fù)方新諾明、多粘菌素B、痢特靈、羅美沙星、美洛西林、強力霉素8種藥物耐藥。

2.5 16SrDNA基因序列分析 用16SrDNA試劑盒擴增分離菌的16SrDNA片段后瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察，在600bp左右有1條特異條帶（圖1）；克隆至T載體后以EocRⅠ酶切，可見1條3 000bp的載體片段和1條600bp的目的條帶（圖2）。陽性質(zhì)粒經(jīng)南京金斯特科技有限公司測序；將測定的序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST搜索比對，結(jié)果為都柏林沙門菌。

3 討論

3.1 禽類，特別是幼禽感染禽副傷寒沙門菌多呈急性或亞急性癥狀，其臨床癥狀和剖檢病變并不具有特征性的診斷意義［5］。本次病例中感染家禽的臨床診斷與病例剖檢為心包炎、氣囊炎、肝周炎的病理變化，易被誤診為單方面由大腸桿菌感染引起該病。根據(jù)本試驗中分離菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生化特性可初步鑒定為腸桿菌科、沙門菌屬，再通過該菌株的血清型及16SrDNA基因序列分析的結(jié)果均符合都柏林沙門菌的生物學(xué)特性，故可判定本試驗中分離株為都柏林沙門菌。由于細(xì)菌菌株的16S rRNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息，使16SrRNA基因成為了公認(rèn)的細(xì)菌分類指標(biāo)［6］，因而將測定細(xì)菌的16S rRNA基因進行序列分析，運用于細(xì)菌的鑒定。現(xiàn)今16SrDNA序列分析是目前較好的快速而直接的檢測微生物的分子生物學(xué)技術(shù)的方法之一，已經(jīng)被廣泛使用［7］。雖然現(xiàn)今有些沙門菌的抗原模式發(fā)生變異對鑒定結(jié)果有影響，但通過16SrDNA基因序列分析保證了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而能對此次病例的診斷做出正確的判定。

3.2 都柏林沙門菌的自然宿主是牛、羊［8］，并且是一種潛在的人畜共患病。國內(nèi)外均有報道，都柏林沙門菌除了造成牛、羊流產(chǎn)、死亡外，還會引起人源性的食物中毒［3，9－11］。通過調(diào)查分析，國外專家認(rèn)為，未經(jīng)巴氏消毒的牛奶、奶制品和牛肉及牛肝臟是都柏林沙門菌的主要感染源［8－9］。國內(nèi)曾報道過，因食用被都柏林沙門污染的食品而引起的食物中毒，其通常引起人惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱等主要癥狀，并且能從被污染的食物和人的血液或糞便大多能分離到該病原菌［3，10－12］。因此，人感染都柏林沙門菌引起的食物中毒，大都是由于食用食物周圍環(huán)境不良引起沙門菌的污染，而從禽類分離到的都柏林沙門菌也可能是由于周圍的飼養(yǎng)環(huán)境管理不善所引起的［3］。若這種被污染的禽類肉制品沒有被及時處理掉，而流入市場，仍會引起人的食物中毒。2011年，馬來西亞曾報道過病鴨是食源性沙門菌感染的重要感染源［13］。因此，有關(guān)部門對肉制品的檢驗檢測中，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行《食品衛(wèi)生法》，以防控食源性食物中毒的發(fā)生。當(dāng)然，養(yǎng)殖戶也應(yīng)做到規(guī)范養(yǎng)殖，對養(yǎng)殖水域進行有效的消毒措施，加強水禽常見疾病的常規(guī)防制，提高禽類的免疫力，做好從源頭對病原防控。

3.3 藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株對多種藥物耐藥，同時也對多種藥物敏感，建議該養(yǎng)殖戶使用氟哌酸治療。

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