鴨源大腸桿菌和沙門菌混合感染的分離鑒定及藥敏試驗

林 安，喻 元，胡嵐嵐，伍 莉，2

（1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460；2.重慶市獸藥工程技術研究中心，重慶 北碚400715）

近年來，為控制與大腸桿菌和沙門菌感染有關的禽類死亡，某些抗菌藥物在臨床上進行了廣泛使用，這不可避免地導致細菌對藥物產生耐藥性。為了解和掌握鴨大腸桿菌和沙門菌混合感染的情況以及耐藥程度，為臨床上有效預防和治療藥物的篩選提供依據，本試驗對榮昌縣某鴨場發病雛鴨分離的細菌進行了實驗室診斷和藥敏試驗，以期望為更有效地防控該病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采集重慶市榮昌縣某鴨場病死雛鴨的肝、脾臟等組織，低溫保存送回實驗室待檢。

1.2 培養基及試劑 普通瓊脂培養基、營養肉湯增菌培養基、麥康凱培養基、S.S.培養基、三糖鐵培養基、細菌微量生化鑒定管（批號：101226）、藥敏紙片（批號：110104）、腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊（第二代GYZ－15e），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗動物 昆明系健康小鼠16只，購自重慶醫科大學實驗動物中心，體重18.0～22.0g，雌雄各半；購自榮昌縣某孵化場的2日齡健康花邊雛鴨40只，雌雄各半，觀察2d后用于動物回歸試驗。

1.4 細菌的分離、純化 將采集的病料接種于普通瓊脂培養基，37℃培養18～24h，選取疑似菌落進行分離菌的抹片，革蘭染色，鏡檢。于菌種管內取菌液在S.S.培養基和麥康凱培養基進行劃線，37℃培養18～24h，觀察菌落生長特點［4］。

1.5 生化試驗 將分離菌株活化后接種到營養瓊脂斜面培養基，進行15項生化試驗，參照腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊（第二代GYZ－15e）計算編碼值，確定細菌種類。

1.6 致病性試驗 16只健康小鼠分成4組，每組4只，1組腹腔注射大腸桿菌菌懸液0.2mL／只（2×1010CFU／mL）；2組腹腔注射沙門菌菌懸液0.2mL／只（2×1010CFU／mL）；3組同時腹腔注射沙門菌和大腸桿菌菌懸液各0.1mL／只；4組為對照組，腹腔注射滅菌普通肉湯0.2mL／只。對注射后的小鼠隔離飼養，觀察其發病及死亡情況［2］，并從死亡小鼠的肝、脾組織中回收細菌進行生化試驗，判斷細菌種類。

1.7 藥敏試驗 采用WHO推薦的K－B紙片瓊脂擴散法進行［3］，按臨床實驗室標準研究所（CLSI）2010年標準判斷結果。

1.8 動物回歸試驗 40只2日齡雛鴨飼養2d后分為4組，每組10只。1組腹腔接種沙門菌菌懸液0.5mL／只（2×1010CFU／mL）；2組腹腔接種大腸桿菌菌懸液0.5mL／只（2×1010CFU／mL）；3組分別腹腔接種大腸桿菌和沙門菌菌懸液各0.25mL／只；4組為對照組，腹腔注射滅菌普通肉湯0.5mL／只。對注射后的雛鴨隔離飼養，觀察其發病及死亡情況，并對死亡雛鴨立即剖檢，觀察病理學變化。無菌采取死亡雛鴨的肝、脾組織，涂片、染色、鏡檢，并在麥康凱瓊脂上劃線分離，37℃培養24h，觀察菌落形態、大小。

2 試驗結果

2.1 細菌分離、純化 病料在培養基上分離出A、B兩種菌株。普通瓊脂上：A菌為圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、灰白色半透明、中等大小的菌落；B菌為圓形、表面光滑、邊緣整齊、無色半透明、中等大小的菌落。在麥康凱瓊脂平板上：A菌形成較大、紅色、圓形、邊緣整齊、中央隆起的菌落；B菌形成中等、無色透明、邊緣整齊、中央隆起的菌落。在S.S.瓊脂上：A菌形成圓形、中心混濁的紫紅色菌落；B菌形成圓形、透明的無色菌落。把兩種細菌進行鏡檢：A菌為革蘭陰性、中等大小、兩端略圓的短粗桿菌，呈單個存在、也有成雙排列；B菌為革蘭陰性、較前者大、直桿菌。鏡檢后將兩種菌分別接種于麥康凱培養基和S.S.培養基中，讓其純化生長，然后將純化的兩種菌分別接種到營養肉湯中作增菌培養，接種A菌的肉湯呈均勻混濁，管底有絮狀沉淀，液面有菌環；接種B菌的肉湯呈均勻混濁，管底有絮狀沉淀，液面無菌環。

2.2 生化試驗 生化試驗結果見表1。參照腸桿菌科細菌生化鑒定編碼（第二代GYV－15e），結合細菌的生化試驗與分離特性，判定A菌為大腸埃希菌（編碼值：06174），B菌為豬霍亂沙門菌（編碼值：42165）。

表1 生化試驗結果（n＝3）

2.3 致病性試驗 小鼠接種細菌24h后，1組死亡3只，2組死亡2只，3組全部死亡，4組小鼠健康存活，未出現發病或死亡現象。死亡鼠剖檢變化典型，并從肝、脾組織中回收細菌，通過麥康凱培養基培養、生化鑒定、鏡檢等檢出的兩種細菌和原分離的兩種菌株一樣，即A菌為大腸埃希菌，B菌為豬霍亂沙門菌。

2.4 藥敏試驗 試驗結果見表2。大腸桿菌對氨芐西林等7種抗菌藥物高敏；對阿莫西林中敏；對恩諾沙星等6種藥物耐藥。沙門菌對慶大霉素等7種藥物高敏；對強力霉素中敏；對氧氟沙星等6種藥物耐藥。經比較發現，對大腸桿菌和沙門菌都高度敏感的藥物有頭孢唑啉、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、多黏菌素B等5種抗菌藥物，它們可作為該養鴨場防治鴨源大腸桿菌和沙門菌混合感染的首選藥物。

表2 藥敏試驗結果（n＝6）

大腸桿菌對恩諾沙星等6種藥物耐藥，沙門菌對氧氟沙星等6種藥物耐藥。兩種細菌均對氟喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺類的復方新諾明具有很強的耐藥性；多重耐藥譜顯示，大腸桿菌呈現四重耐藥，沙門菌呈現三重耐藥。

2.5 動物回歸試驗 雛鴨感染細菌后24h后開始出現臨床癥狀，甚至死亡。48h后，1組死亡7只，2組死亡8只，3組全部死亡，4組未出現發病或死亡。分別從病死雛鴨的肝、脾組織接種細菌，通過麥康凱培養基培養、生化鑒定、鏡檢等檢出的兩種菌和原分離的兩種菌株一樣，即A菌為大腸埃希菌，B菌為豬霍亂沙門菌。

3 分析與討論

本試驗分離到的鴨源大腸埃希氏菌和豬霍亂沙門菌，均具有較強的致病性。藥敏試驗結果表明，分離菌對頭孢唑啉、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、多黏菌素B等5種抗菌藥物高敏，它們可作為該場防治大腸桿菌和沙門菌混合感染的首選藥物。兩種細菌均對氟喹諾酮類的諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和磺胺類的復方新諾明具有很強的耐藥性，因此，臨床上該場要禁用上述耐藥性藥物。

在應用抗生素治療細菌感染時，要有明確的臨床指征［4］。應根據臨床癥狀、病例剖檢，再結合實驗室檢驗結果進行綜合診斷，找出病原，合理選擇用藥，不可在不明病因的情況下盲目用藥。臨床實踐證明，長時間單用一種藥物防治某種疾病，不僅治療效果不佳，而且容易使細菌產生耐藥性，而適當的聯合使用敏感的抗生素能達到療效協同或相加，減少毒性，防止或延緩耐藥菌株產生的目的。

根據本次試驗結果，建議該養鴨場應定期分離雛鴨大腸桿菌和沙門菌的優勢菌株，及時對產蛋鴨和雛鴨進行免疫接種；臨床用藥以藥敏試驗結果為依據，采用多途徑、聯合、交叉等合理用藥方案，加上科學的飼養管理，搞好環境衛生等多方面的措施，才能收到良好效果。此外，對該類細菌性疾病的防制不能完全依賴藥物治療或預防，應該把重點放在強化生物安全措施、改善飼養管理條件上。經常保持舍內的環境干燥、衛生、溫度和濕度適宜，空氣清新，喂飼易消化吸收的全價飼料，供給多種維生素，以預防為主，治療為輔。

［1］陸承平.獸醫微生物學［M］.3版.北京：中國農業出版社，2001：215－231.

［2］姚火春.獸醫微生物學實驗指導［M］.北京：中國農業出版社，2006：36－42.

［3］桂炳東，孫敬，徐建民.細菌藥物敏感性試驗測定手冊［M］.南昌：江西科學技術出版社，2001：28－29.

［4］劉山輝.抗菌藥物的藥敏試驗方法［J］.吉林畜牧獸醫，2003，24（12）：49－50.