神秘果種子蛋白質的提取與降糖效用研究

黃巨波，劉 紅，盧圣樓，張 浩

海南師范大學化學與化工學院，海口571127

神秘果種子蛋白質的提取與降糖效用研究

黃巨波，劉 紅*，盧圣樓，張 浩

海南師范大學化學與化工學院，海口571127

本文研究神秘果種子蛋白質(SDSP)的提取條件及其降糖效用，通過考察固液比、pH值、時間和溫度等因素對SDSP提取率的影響來優化提取蛋白質的條件，并利用四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型分析神秘果種子蛋白質的降糖效果。實驗方法如下:將實驗組小鼠分為正常對照組、糖尿病模型組、SDSP實驗組(200 mg/kg)和陽性對照組(80 mg/kg二甲雙胍)，灌胃14 d后測量空腹血糖值(FBG)，胰島素含量和體重。實驗結果表明SDSP的最佳提取工藝條件為固液比1∶20、pH 8.5、時間120 min、溫度50℃。測定SDSP組的FBG含量比模型組降低46%，而胰島素含量則增加約4倍。實驗表明SDSP顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促進胰島素的分泌。

神秘果;蛋白質;四氧嘧啶;降糖效用

神秘果為山欖科(Sapotaceae)神秘屬(Synsepalum)常綠灌木，是一種稀有的種植資源，原產于西非，自然分布在西非剛果一帶，在印度尼西亞的叢林中也有發現，自20世紀60年代起先后引入我國海南、廣東、廣西、福建等省區種植［1，2］。近期研究發現，果實中含有的神秘果素除了能夠改變味覺外［3，5］，還具有改善胰島素抵抗的功能［4］，說明神秘果可作為糖尿病人的輔助治療藥物進行開發利用，為進一步考察神秘果對糖尿病的治療作用［6］，本文從神秘果種子中提取蛋白質，確定最佳工藝條件，并用提取出的蛋白質對小鼠進行實驗，研究其對糖尿病小鼠的降血糖效用［7-9］，為糖尿病治療進一步提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和儀器

新鮮神秘果(海南本地)由海南師范大學生命科學院鐘瓊芯副教授鑒定

昆明種♂小鼠由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(粵)2008-0020

血糖儀(三諾安穩)小鼠胰島素試劑盒(南京建成生物工程研究所)四氧嘧啶和牛血清白蛋白(Sigma公司)二甲雙胍(石家莊普力制藥)其余試劑均為分析純

1.2 神秘果種子蛋白質(SDSP)的提取

將新鮮的神秘果去除果肉得種子，冷凍干燥、研磨，得神秘果種子粉，用凱氏定氮法測其蛋白質含量［10］。準確稱取神秘果種子粉(2 g左右)于消化瓶中，加入催化劑(K2SO4和CuSO4)，濃H2SO420 mL，消化至呈綠色，冷卻加水定容，用硼酸作吸收液，反應室內加入濃NaOH，用0.05N HCl滴定。在神秘果種子粉中加入石油醚或環己烷攪拌脫去其油脂部分，抽濾分離，在去除油脂的種子粉中加入磷酸鹽的緩沖溶液(并加入少量的巰基乙醇和氯化鈉，以防止蛋白質變性和有利于蛋白質的溶解)，室溫攪拌過夜，抽提得到蛋白質提取液。取抽提液樣品稀釋至適當的倍數，用考馬斯亮藍法(即Bradford法)測定粗提液中蛋白質含量［11］，計算提取率(粗蛋白提取率=粗提液中蛋白質質量/種子粉中蛋白質質量)。

1.3 正交實驗

為確定SDSP的最佳提取條件，設計以固液比、pH值、時間和溫度為條件的L9(34)正交優化實驗，各因素所取條件見表1所示。

表1 SDSP提取正交實驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of extraction of SDSP

1.4 降糖活性研究

1.4.1 建立糖尿病模型

預選健康♂小鼠40只(20 g左右)，先適應性飼養一周，禁食12 h，腹腔注射四氧嘧啶180 mg/ kg，72 h后空腹血糖值12 mmol/L以上為高血糖小鼠，造型成功。

1.4.2 神秘果蛋白對糖尿病小鼠的降血糖研究

取10只正常小鼠作為(1)空白對照組，和上述造型成功的高血糖值小鼠30只，按血糖值、體重隨機分為(2)模型組(蒸餾水)，(3)實驗組(200 mg/kg SDSP)，(4)陽性對照組(80 mg/kg二甲雙胍)，每組10只。小鼠分籠飼養，按劑量灌胃一次/天，空白對照組和模型組灌蒸餾水，實驗組灌胃SDSP 200 mg/ kg，陽性對照組灌胃二甲雙胍80 mg/kg，自由進食、飲水，記錄飲水量，測體重、血糖值/周。實驗第14天，禁食12 h，腹腔注射500 mg/kg葡萄糖，90 min后測量血液中胰島素含量。

1.5 數據處理方法

2 實驗結果

2.1 神秘果提取條件優化

以牛血清蛋白(BSA)作為標準，以蛋白質濃度為橫坐標，A595為縱坐標作蛋白質濃度標準曲線，如圖1，由此可測得各粗提取液中蛋白質含量。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Standard curve of protein

各組試驗神秘果種子蛋白質提取率和極差分析結果見表2，方差分析見表3。對表2數據進行直觀分析可知，以蛋白質提取率為評價指標，各因素的影響順序為:固液比＞溫度＞pH＞時間，最佳工藝條件為A3B1C3D2。方差分析結果顯示:固液比F= 1.549和溫度F=1.56＜F(2，8)0.05=4.46，說明固液比和溫度對蛋白質提取率都沒有顯著性影響，即表明在實驗操作條件下溫度40～60℃以及固液比10∶1～20∶1條件下對蛋白質提取率的影響不顯著。綜合以上情況考慮，選取A3B1C3D2，即溫度50℃、pH值8.5、固液比1∶20、時間120 min為最佳提取工藝條件提取SDSP，提取率可達到80.3%。

為考察上述最佳提取工藝的可操作性和穩定性，嚴格按照工藝條件要求提取SDSP 3次，進行驗證試驗。結果表明:按優選的最佳工藝條件提取SDSP，提取率較高，且工藝穩定。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment of extraction rate

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance

2.2 降血糖實驗

模型組小鼠“三多一少”癥狀明顯，并逐漸加重;而實驗組和陽性對照組小鼠癥狀較輕，且逐漸緩解。表4中各項實驗數據表明，喂食SDSP的糖尿病實驗組小鼠空腹血糖值較模型組降低，差異顯著(P＜0.01)，陽性對照組小鼠血糖值也明顯降低(P＜0.01)。實驗結束時，實驗組和陽性對照組小鼠的血糖值趨近于正常值，實驗組小鼠腹腔注射葡萄糖后胰島素含量高于模型組，差異顯著(P＜0.01)。較模型組，正常對照組小鼠體重增加，差異顯著(P＜0.01)，實驗組和陽性對照組小鼠體重增加，差異不顯著。

表4 SDSP對糖尿病小鼠血糖值、胰島素含量和體重的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

表4 SDSP對糖尿病小鼠血糖值、胰島素含量和體重的影響(±s，n=10)Table 4 Effects of SDSP on FBG，INS and weight of diabetes mice(±s，n=10)

與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with model group:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

體重(g)組別Group劑量(mg·kg－1) Dosage血糖值(mmol/L) Blood glucose level胰島素含量(mU/L) Insulin content Weight 0 d 7 d 14 d 14 d 0 d 14 d正常對照組 － 5.8±0.4＊＊ 5.6±0.3＊＊ 5.6±0.2＊＊ 18.3±2.6 21.4±0.5 28.4±0.8＊＊模型組 － 16.5±2.6 15.6±2.9 15.2±3.0 20.6±7.8 20.1±1.1 20.8±1.8實驗組 200 16.2±2.2 13.5±2.6* 8.1±2.4＊＊ 79.5±6.1＊＊ 20.7±0.9 23.2±3.4*陽性對照組 80 16.8±1.8 14.3±2.1* 7.5±2.4＊＊ 25.3±6.6 21.7±1.5 22.2±2.9*

3 討論

現有治療糖尿病的藥物一般是通過刺激殘存β細胞的胰島素分泌［12］，或是抑制胰高血糖素分泌，來降低和控制患者的血糖值，而四氧嘧啶是一種特異性的β細胞毒劑，可選擇性地損壞多種動物的胰島β細胞，引起實驗性糖尿病。研究糖尿病治療藥物療效的常用動物模型為四氧嘧啶糖尿病小鼠。

本實驗通過設計正交實驗，優選出提取SDSP的最佳工藝條件為溫度為50℃、pH值為8.5、固液比為1∶20、時間為120 min。在降血糖實驗中，實驗組小鼠血糖值較模型組降低(P＜0.01)，空腹注射葡萄糖后胰島素含量高于模型組(P＜0.01)，說明SDSP能有效地降低糖尿病小鼠空腹血糖值和促進胰島素的分泌，但其分離純化、降糖機理等還需進一步研究證明。

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Study on Hypoglycemic Activity and Extraction of Synsepalum Dulcificum Seed Protein

HUANG Ju-bo，LIU Hong*，LU Sheng-lou，ZHANG Hao
College of Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571127，China

To investigate the extraction efficiency and hypoglycemic activity of Synsepalum Dulcificum seed protein(SDSP)，conditions are investigated by the ratio of solid to liquid，pH，time and temperature to get better extract rate，the hypoglycemic activity in diabetic mice induced by intraperitoneal injection of alloxan(180 mg/kg)were done as follows.All the mice were divided into four groups randomly，including normal control group，model group，SDSP group(200 mg/ kg)，metfomin group(80 mg/kg)，weight and fluid intake were monitored every week，fasting blood glucose(FBG)and insulin were measured after 2 weeks.The optimum extracting conditions:ratio of solid to liquid(w∶v)1∶30，pH 8.5，time 120 min，temperature 50℃.Compared with diabetic model group，the levels of FBG were decreased remarkably to 46%and insulin was increased 4 times in the SDSP group.It demonstrated that the SDSP could significantly lower blood glucose and promote the secretion of insulin of diabetic mice.

Synsepalum Dulcificum;protein;alloxan;hypoglycemic

1001-6880(2012)10-1441-04

2012-01-10 接受日期:2012-06-20

海南省社會發展專項(2010SF007);海口市重點科技計劃(2010-086);海南師范大學科技成果轉化項目(JJCG1101);海南師范大學實驗室開放性項目(KFSY11007)

*通訊作者 E-mail:lhyd123@sohu.com

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