穴位注射川芎嗪抑制氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的實驗研究

易細香 傅 培 徐 敏

視網(wǎng)膜新生血管形成，是導致糖尿病視網(wǎng)膜病變、眼底血管栓塞、缺血性眼病等最終視力喪失的重要原因，迄今尚無有效的藥物治療方法。本研究首次應(yīng)用高濃度氧誘導C57BL/6J小鼠建立視網(wǎng)膜新生血管病變模型，通過新生血管內(nèi)皮細胞核計數(shù)及血清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量檢測，觀察太陽穴（顳淺動脈旁）注射和鼠尾靜脈注射川芎嗪對視網(wǎng)膜新生血管形成的影響，旨在從組織形態(tài)學、分子生物學方面探討注射川芎嗪抑制視網(wǎng)膜新生血管形成的機理，為治療血管源性眼病開辟新的安全有效用藥方式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：鼠齡7 d的健康C57BL/6J幼鼠60只，性別不限，未斷奶，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，系清潔級動物，由廣州動物實驗室提供，動物合格證號：0097634。

1.1.2 主要設(shè)備與試劑：電腦氧氣濃度控制儀、光學顯微鏡，VEGF檢測相關(guān)設(shè)備均由我院中心實驗室提供。小鼠抗小鼠VEGF單抗（SANTA CRUZ公司）；即用型SABC-AP免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）；鹽酸川芎嗪注射液（20 mg/ml，常州制藥廠生產(chǎn)，批號：001002）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組：參考 Smith 等〔1〕和張正培等〔2〕的方法建立氧誘導的血管增生性視網(wǎng)膜病變幼鼠模型。取健康幼鼠（鼠齡出生后第7天）C57BL/6J 60只，隨機分為正常對照組、模型對照組、穴位注射組、全身用藥組，每組15只，與哺乳母鼠一起置于干燥密閉玻璃容器內(nèi)，提供足夠的食物及水，后3組予以持續(xù)高氧混合氣體（75%氧氣和25%氮氣），在此高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d后將幼鼠取出，回到正常空氣環(huán)境下飼養(yǎng)，建立氧誘導視網(wǎng)膜新生血管病變幼鼠模型。根據(jù)Smith〔1〕的實驗結(jié)果，該動物模型至鼠齡第17天時視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生率為100%。

1.2.2 給藥方法：（1）穴位注射組：使用裝有川芎嗪稀釋液的微量注射器于小鼠右側(cè)太陽穴進針1～3 mm，捻轉(zhuǎn)刺激后推注川芎嗪注射液0.2 ml（稀釋10倍，含川芎嗪 0.4 mg），每日 1次，連續(xù) 7 d。（2）全身用藥組：鼠尾靜脈注射川芎嗪稀釋液0.2 ml（稀釋10倍，含川芎嗪 0.4 mg），每日 1次，連續(xù)給藥 7 d。（3）模型對照組：鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 視網(wǎng)膜新生血管細胞核計數(shù)：采用雙盲法，注射結(jié)束5 d后處死所有小鼠，取出右眼，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脫水、透明、浸蠟，做6 μm厚連續(xù)切片，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位平面。常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察結(jié)果。每只眼球間斷取10個不含視盤的切片，相鄰2個切片間隔60 μm（10個切片）。計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)目，統(tǒng)計平均每只眼球每張切片突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)。

1.2.4 動物血清VEGF含量測定：小鼠處死后眼球采血。采用雙抗體夾心法測定血清血管內(nèi)皮細胞生長因子含量，操作方法按說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 10.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清VEGF含量

正常對照組、穴位注射組和全身用藥組的血清VEGF濃度均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）；穴位注射組與全身用藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 1）。

表1 各組實驗鼠血清VEGF含量（±s）

表1 各組實驗鼠血清VEGF含量（±s）

注：與模型對照組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與穴位注射組比較，P＞0.05（獨立樣本t檢驗）。VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別 實驗鼠數(shù)量/只 血清VEGF含量/(μg／L)正常對照組 15 9.28±1.26①模型對照組 15 18.31±4.33穴位注射組 15 13.35±2.41②全身用藥組 15 12.37±3.11②③

2.2 視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)

正常對照組15只眼中有5只眼見極少數(shù)突破內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜血管芽，其細胞核數(shù)為1～10個，其余10只眼均未見視網(wǎng)膜新生血管芽。造模各組均可見視網(wǎng)膜新生血管芽，發(fā)生率為100%。模型對照組的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明造模是成功的。穴位注射組、全身用藥組的視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；穴位注射組與全身用藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 2，圖 1）。

表2 各組實驗鼠視網(wǎng)膜新生血管細胞核計數(shù)結(jié)果（±s）

表2 各組實驗鼠視網(wǎng)膜新生血管細胞核計數(shù)結(jié)果（±s）

注：與模型對照組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與穴位注射組比較，P＞0.05（獨立樣本 t檢驗）。

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3 討論

大量研究表明，缺氧是導致視網(wǎng)膜新生血管形成的主要刺激因素，將出生后1周內(nèi)的C57BL/6J幼鼠置于75%濃度氧的環(huán)境中連續(xù)生活5 d，即可見大量的視網(wǎng)膜新生血管形成〔1〕。很多細胞因子如VEGF參與了視網(wǎng)膜新生血管的形成過程〔3〕，缺氧可促進VEGF的合成〔4〕，VEGF表達持續(xù)增加可導致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞及視網(wǎng)膜色素上皮細胞過度增殖、微血管化，進而形成新生血管，引起明顯的新生血管增生性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生〔5-6〕。本文通過視網(wǎng)膜新生血管芽細胞核計數(shù)來判斷視網(wǎng)膜新生血管的增殖程度，新生血管芽細胞核數(shù)越多表明視網(wǎng)膜新生血管增殖越嚴重。各組模型鼠血清VEGF含量及視網(wǎng)膜新生血管芽細胞核計數(shù)均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明 VEGF參與了模型鼠視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生。

視網(wǎng)膜新生血管形成，是導致糖尿病視網(wǎng)膜病變、眼底血管栓塞、缺血性眼病等視力喪失的重要原因。對于視網(wǎng)膜新生血管的治療，迄今尚無有效的藥物治療方法。激光光凝、光動力療法，玻璃體腔注射VEGF拮抗類藥物，玻璃體切割術(shù)等均為有創(chuàng)治療，可能導致視網(wǎng)膜脫離、眼內(nèi)感染，尋找安全有效的治療藥物是目前眼科學界關(guān)注的問題。

中藥川芎含有川芎嗪、阿魏酸鈉、川芎內(nèi)酯等，川芎嗪是其主要有效活性成分。川芎嗪有較強的擴張微血管作用，可改善微循環(huán)，降低血黏度，改善血液流變，并有降低毛細血管通透性、調(diào)節(jié)血小板功能和抗凝作用〔7〕。川芎嗪對晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）誘導的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞產(chǎn)生VEGF具有抑制作用；可通過抑制DNA合成來抑制成纖維細胞的增殖〔4〕。玻璃體腔內(nèi)注入川芎嗪能抑制眼內(nèi)纖維增生，對防治增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferativevitreoretinopathy，PVR）有效〔8〕。

穴位注射是傳統(tǒng)針灸療法與現(xiàn)代注射、封閉方法相結(jié)合的產(chǎn)物，是一種中西醫(yī)結(jié)合的有效而無副作用的治療方法。川芎嗪穴位注射能降低實驗性高眼壓兔的眼壓，保護和修復高眼壓下視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的損傷〔9〕。雙側(cè)針刺糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠睛明、太陽等穴，可以使大鼠微血管病變得到顯著改善〔10〕。太陽穴位于顳淺動脈旁，顳淺動脈旁注射復方樟柳堿治療缺血性眼底病已在臨床上得到廣泛應(yīng)用〔11-12〕，其機制是通過顳淺動脈旁的自主神經(jīng)末梢使脈絡(luò)膜血管活性物質(zhì)維持正常水平，恢復脈絡(luò)膜血管正常舒縮功能，增加眼血流量，還有助于促進側(cè)支循環(huán)建立，從而減輕脈絡(luò)膜缺血導致的視神經(jīng)、視網(wǎng)膜缺血。提示太陽穴藥物注射對于改善眼部供血具有一定作用。

從本實驗結(jié)果可以看到，應(yīng)用川芎嗪后，穴位注射組與靜脈注藥組小鼠血清VEGF含量及視網(wǎng)膜新生血管細胞核數(shù)目均明顯低于模型對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這一結(jié)果說明川芎嗪對視網(wǎng)膜新生血管增殖具有抑制作用，同時也說明了視網(wǎng)膜新生血管芽的減少與血清VEGF含量的降低有關(guān)，與李景恒的研究結(jié)果一致〔13〕。川芎嗪穴位注射與靜脈給藥比較，小鼠血清VEGF含量、視網(wǎng)膜新生血管芽數(shù)目差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明川芎嗪穴位注射與靜脈給藥療效相當。穴位注射安全有效、簡便實用，為治療血管源性眼病開辟了新的途徑。

視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展是一個極為復雜的過程，除VEGF以外，還可能涉及多條通路和多種細胞因子，尚有待于進一步研究。另一方面，目前中藥治療視網(wǎng)膜新生血管增殖尚處于初期研究階段，有關(guān)其他給藥方式以及中藥眼科用藥新劑型的開發(fā)等，也均具有很好的研究和應(yīng)用前景。

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