清解活血湯對兔自身免疫性視網膜血管炎病理學變化的影響

宋 柯 張津京 李慶生 江 偉 張 紅 鎮 華

視網膜血管炎是一類累及視網膜血管的疾病，常同時伴有脈絡膜和玻璃體炎癥反應，病情重者可引起黃斑水腫等并發癥，嚴重危害視力，甚至失明，一般難以治愈。我們結合多年臨床經驗，應用清解活血湯加減（即黃連解毒湯與桃紅四物湯的合方加減）治療視網膜血管炎取得了一定的療效，并在前期的實驗中對不同中藥干預慶大霉素致青紫藍兔視網膜血管損傷的動物模型進行了實驗研究〔1〕。本實驗在前人研究的基礎上，采用玻璃體腔注射牛血清白蛋白建立自身免疫性視網膜血管炎模型，觀察清解活血湯對該模型動物組織病理學的影響，期望能為視網膜血管炎及類似血管損傷性疾病的基礎研究提供一些實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：青紫藍兔40只，雌雄各半，體質量2～2.5 kg，購自北京天壇生物制品股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）2009-0010。

1.1.2 中藥制備：采用清熱解毒活血方，組成：黃連10 g、黃芩 10 g、黃柏 10 g、梔子 10 g、紫草 10 g、紅花10 g。購自北京燕北飲片廠，批號090816。經中藥師鑒定并水煎制成濃縮液，高劑量組相當于臨床劑量4倍；低劑量組相當于臨床劑量2倍，具體按照《藥理實驗方法學》折算。

1.1.3 其它主要藥物和試劑：地塞米松磷酸鈉注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號0820221）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）、戊巴比妥鈉、多聚甲醛（美國sigma公司）；蘇木素-伊紅（H-E）（天合力恩化學試劑公司，批號20031024）、戊二醛（Merck 公司）、丙酮（北京化工廠，批號 20021216）、樹脂包埋劑（SERVA公司）。

1.2 主要儀器

直接檢眼鏡（HEINE公司）、手術顯微鏡（YZ20T4，蘇州六六視覺科技股份有限公司）、眼底照相機（Topcon公司）、光學顯微鏡及數碼照相裝置（OLMPUS公司）、透射電子顯微鏡（HITACHI-7650，日本）。

1.3 造模與分組

1.3.1 模型制備：（1）預免疫（足底皮下注射）：將2%BSA生理鹽水溶液與CFA等體積的混合乳液予青紫藍兔雙后足底皮下注射，每次各足底注射0.1 ml，共注射4次，每次間隔7 d。（2）終免疫（玻璃體腔注射）：足底末次注射完7 d后，各兔雙眼玻璃體腔分別注射 BSA 生理鹽水溶液 0.05 ml（含 BSA 25 μg）。

1.3.2 分組治療：將40只實驗兔隨機分為5組，每組8只，分別為正常對照組、空白對照對照組、陽性對照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組。正常對照組不做任何處理，其他4組動物進行造模，完成造模12 h后開始給藥。空白對照組給予生理鹽水灌胃，2次/日，5 ml/次；陽性對照組給予腹腔注射地塞米松磷酸鈉注射液，劑量按人每天10 mg折算，1次/日；中藥各組給予不同濃度中藥灌胃，2次/日，5 ml/次。

1.4 實驗觀察

1.4.1 大體狀況：觀察實驗兔外觀、足底注射部位、四肢關節等情況。

1.4.2 眼部體征：裂隙燈及檢眼鏡觀察實驗兔眼部情況。

1.4.3 光學顯微鏡觀察：分別于給藥7 d及14 d時，全麻狀態下各摘除4只實驗兔雙眼。予4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色觀察。

2 結果

2.1 大體狀況觀察

模型兔行第2次足底注射時，毛發稍有脫落、光澤欠佳，足底見潰瘍；第3次注射時，頸背部毛發稀疏、部分脫落，全身消瘦，足底潰瘍明顯，1只實驗兔雙腿膝關節見類風濕性關節炎表現；第4次注射時，毛發大部分脫落，可見皮膚組織，皮下血管暴露，全身消瘦明顯，足底潰瘍范圍擴大。

2.2 眼部體征

2.2.1 前房及玻璃體炎癥表現：正常組未見異常。空白對照組玻璃體腔注射后12 h瞳孔緣見纖維性滲出，玻璃體輕度混濁。注射24 h后瞳孔緣滲出物增多，玻璃體混濁加重，眼底不清。注射后第5天玻璃體混濁減輕，第7天瞳孔緣纖維滲出物較前減少，玻璃體混濁明顯減輕。第14天瞳孔緣滲出物基本消失，玻璃體混濁進一步減輕。陽性對照組及中藥高低劑量組青紫藍兔瞳孔緣纖維滲出物呈逐漸減少趨勢，最后消失，玻璃體混濁變化與之大致相同。

2.2.2 眼底表現：正常組眼底未見異常。空白對照組玻璃體腔注射后12 h見視盤水腫，視網膜點片狀出血，靜脈呈節段狀阻塞，近視盤處靜脈粗大迂曲。注射后第7天見視網膜水腫，大量出血，動脈細，靜脈粗大迂曲，第14天視網膜出血略減少，視盤水腫無變化。陽性對照組第14天視網膜出血減少，視盤水腫無明顯變化，其余大致同空白對照組。中藥高劑量組第7天眼底視盤水腫，視網膜見出血，部分色素紊亂，第14天視盤水腫明顯減輕，視網膜出血明顯減少，近視盤處可見部分靜脈略粗大迂曲。中藥低劑量組第14天視盤略水腫，出血減少呈點片狀。

2.3 光學顯微鏡觀察

最早出現變化的是RPE細胞和視網膜感光細胞，其次是神經節細胞層及神經纖維層。空白對照組玻璃體腔注射后第7天，視網膜水腫、出血，血管區域見大量紅細胞及炎性細胞，玻璃體及脈絡膜血管區也可見大量炎性細胞，感光細胞層排列紊亂，RPE細胞色素增多、遷移或團簇；第14天內、外顆粒層排列不齊，神經纖維層見局灶性壞死，感光細胞層排列紊亂、缺失中斷。陽性對照組注射后第7天，視網膜高度水腫伴出血，神經纖維層部分壞死變性，外顆粒層部分缺失，感光細胞層與RPE層脫離，感光細胞部分消失；第14天視網膜水腫減輕，出血減少，內外顆粒層排列不齊。中藥高劑量組第7天視網膜血管區域見大量紅細胞及炎性細胞，感光細胞層排列紊亂；第14天時視網膜出血及炎性細胞明顯減少。中藥低劑量組第7天視網膜部分血管栓塞，周圍炎性細胞浸潤，內、外顆粒層排列不齊，神經纖維層局灶性壞死；第14天視網膜出血及炎性細胞均減少（圖1）。

3 討論

目前有關視網膜血管炎的發病機制尚不清楚，大多學者認為除感染和腫瘤等導致之外，主要由自身免疫反應引起。前人已進行了大量動物實驗研究，如用豬視網膜S抗原聯合弗式佐劑誘導大鼠葡萄膜炎，結果大鼠的眼底表現與特發性視網膜血管炎極為相似〔2〕，隨后有學者使用牛視網膜S抗原、病毒、牛血清白蛋白、弓形體及犬弓蛔蟲等成功造模〔3-7〕。

本實驗參考前人造模方法〔3〕，使用牛血清白蛋白與弗試佐劑足底皮內注射及牛血清白蛋白玻璃體腔注射制作青紫藍兔自身免疫性視網膜血管炎模型。模型動物眼部可見瞳孔緣滲出物，玻璃體炎癥，視盤水腫，靜脈節段性阻塞，視網膜水腫出血；大體見消瘦、毛發脫落、足底潰瘍、關節炎；病理切片顯示視網膜血管區域大量紅細胞及炎性細胞，感光細胞層排列紊亂，RPE細胞色素增多、遷移或團簇，神經纖維層局灶性壞死，說明模型制作是成功的。另一方面，空白對照組、陽性對照組及中藥高低劑量組青紫藍兔眼前節和玻璃體炎癥均由輕到重隨之逐漸減輕，這是否說明牛血清白蛋白誘導的青紫藍兔眼前節和玻璃體炎癥具有自限性，尚有待于進一步研究證實。

西醫對于視網膜血管炎尚無十分有效的治療方法，目前主要給予糖皮質激素及一些免疫抑制劑等治療，必要時予激光及玻璃體切割手術治療，但目前對這些療法的使用仍存在爭議〔2〕。根據該病（突然）視力下降、玻璃體混濁以及眼底出血等特點，可歸入中醫 “暴盲”、“視瞻昏渺”、“云霧移睛”、“螢星滿目”和“目血癥”等范疇。中醫眼科理論認為，眼底出血的病機主要是熱毒壅盛，血熱妄行，或陰虛火旺，虛火上炎，火灼脈絡致血溢脈外，處方以清熱解毒、涼血止血，或滋陰養血止血藥物。導師李慶生主任醫師在臨床上應用清解活血湯加減（即黃連解毒湯與桃紅四物湯的合方加減）治療本病，發現確有一定療效。我們在臨床研究的基礎上〔8〕，前期已用地塞米松、《千金要方》犀角地黃湯（用水牛角代替犀角）、黃連解毒湯和桃紅四物湯等對慶大霉素致家兔視網膜損傷模型進行療效觀察〔1〕，結果發現地塞米松可明顯減少早期出血，抑制炎癥細胞數量，但長時間應用會加重炎癥反應；犀角地黃湯中劑量對慶大霉素致視網膜損傷有明顯的治療作用；黃連解毒湯和桃紅四物湯能明顯改善視網膜出血及炎癥反應，作用效果好于犀角地黃湯。因此本實驗以清解活血湯作為干預手段，觀察該組方對實驗性視網膜血管炎的治療效果。結果表明，清解活血湯可明顯減輕模型兔視盤水腫、視網膜出血，高劑量組的治療作用最好。從病理結果上看，無論造模后第7天還是第14天，中藥高劑量組的視網膜損害、出血及炎性細胞浸潤均明顯輕于空白對照組和陽性對照組，也好于中藥低劑量組。

清解活血湯是黃連解毒湯與桃紅四物湯合方加減，方中黃連、黃芩、黃柏清熱解毒，紫草、梔子、紅花清熱涼血止血。現代藥理研究表明黃連解毒湯具有抗炎、抗菌、抗內毒素等多種作用〔9〕；紅花可通過抑制去甲腎上腺素引起血管運動，增加血流量〔10〕，并通過抑制血漿纖溶酶原激活劑活性以減輕血管損傷〔11-12〕；紫草也具有抗菌抗炎等作用〔13〕。清解活血湯對視網膜血管炎模型動物的治療作用可能與上述中藥的藥理作用有關。

綜上所述，本實驗應用牛血清白蛋白誘導兔自身免疫性視網膜血管炎，其眼部表現和病理改變均與視網膜血管炎接近，因此可作為一種良好的模型供將來研究使用。分組實驗結果顯示，清解活血湯能有效控制模型動物的視網膜出血及炎癥反應，為這一組方的臨床應用提供了實驗支持，至于其治療作用的具體機制，尚有待進一步的研究。

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