前癃通膠囊抑制良性前列腺增生基質細胞TGF-β1表達的體外實驗研究

胡金輝，周 青，黃艷茹，莫興群

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007）

前列腺增生癥即良性前列腺增生(BPH)，臨床以下尿路癥狀或下尿路癥狀加重以及尿路受損為主要表現，部分存在膀胱出口梗阻［1］。隨著社會老齡化，BPH 已成為影響男性健康的常見病、多發病；男性前列腺在青中年時開始出現不同程度組織學增大，隨年齡增長前列腺增生體積呈上升趨勢，而在85 歲以上患者中前列腺總體積增大高達90%［2-3］。良性前列腺增生是由基質和上皮依不同比例混合增生的疾病，且以基質增生為主，年齡越大，增生的基質越多，上皮組織越少[4]。因此，對前列腺基質細胞進行研究具有重要意義。有學者研究發現前列腺內生長因子 TGF-/bFGF 是前列腺增生的重要直接誘因之一［5］，本實驗旨在探討前癃通膠囊對細胞分泌的TGF-β1mRNA 表達的影響；采用MTT 比色法檢測前癃通膠囊對體外培養良性前列腺增生前列腺基質細胞增殖的抑制作用；同時應用逆轉錄-多酶鏈反應（RT-PCR）技術，觀察前癃通膠囊干預下TGF-β1mRNA 在良性前列腺增生基質細胞中的表達的變化，現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法[6]

1.1 材料

1.1.1 藥物 前癃通膠囊：由黃芪、田三七、水蛭、丹參、穿山甲、王不留行等藥物精制而成(由湖南中醫學院附屬一醫院制劑室制成膠囊)，取前癃通膠囊粉末20 g，溶于20 mL 含血清培養液含生藥量6.6 g/mL，再經過濾器過濾。

1.1.2 試劑 MTT （溴化二甲基噻唑二苯四氮唑）、DMSO （二甲基亞砜） 及胰酶均為美國Sigma 公司；1640 培養液（含雙抗）、PBH(磷酸緩沖液)、胎牛血清及冰醋酸均購自北京鼎盛生物工程有限公司; 良性前列腺增生原代基質細胞購于上海拜力生物技術公司；總RNA 提取試劑盒（博大科技生物公司）。

1.1.3 儀器 CO2恒溫培養箱(SHELLAB 公司)；984型低溫冰箱（Forma 公司）；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；相差倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；全自動酶標儀（BIORAD 公司）；離心機（美國Beckman公司）；電泳儀（北京六一公司）；瓊脂糖凝膠電泳槽（北京六一公司）；核酸蛋白分析儀 （德國eppendor公司）；培養板、培養瓶（日本Nuco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將良性前列腺增生原代基質細胞消化到12 個96 孔板，然后按隨機數字表法隨機分成3組，即24、48、72 h 組，貼壁生長后予以藥物處理。

1.2.2 給藥劑量及方法 96 孔板上分設空白、高濃度、中濃度、低濃度組，每個濃度組重復5 次，分別給以細胞培養液、前癃通膠囊 （藥液） 濃度為10、1、0.1 mg/mL，每孔加入100 μL 成細胞懸液，24 h 換液1 次。分別于培養24、48、72 h 后，用注射器吸掉孔內液體，每孔加入100 μL DMSO 混合液，室溫下振蕩5 min。

1.2.3 細胞增殖抑制率的檢測 全自動酶標儀上于450 nm 波長下檢測，檢測24、48、72 h 點的各濃度細胞吸光值A，按照公式：細胞增殖抑制率%=1-(試驗孔A 值-細胞空白組A 值/藥物空白組A 值-細胞空白組A 值)×100%，計算出細胞增殖抑制率OD。

1.2.4 RT-PCR 擴增法 （1）分組 將12 瓶長滿瓶底70%的細胞按隨機數字表法隨機分成4 組，空白組：給予細胞完全培養液，前癃通膠囊高、中、低濃度組分別給予100、50、25 mg/mL，24 h 換液1 次每瓶加5 mL，連續給藥84 h。（2）檢測指標 連續給藥84 h 后提取各樣本細胞的RNA，經核酸蛋白分析儀測RNA 的濃度和純度，分析TGF-β1 在BPH 中的表達量。

1.4 統計學分析

所有資料均經SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析，計量資料用“±s”表示，采用重復測量資料的方差分析。

2 結果

2.1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養基質細胞增殖作用的影響

不同種濃度的前癃通膠囊都能抑制前列腺基質細胞的增殖，且隨著時間的延長抑制作用增強，高濃度組在24、48、72 h 對前列腺基質細胞增殖有明顯的抑制作用，與中濃度組比，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）；中濃度組在24、48、72 h 對前列腺基質細胞增殖起抑制作用，與低濃度組比，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表1。

表1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養基質細胞增殖作用的影響 （±s，n=5）

表1 不同濃度前癃通膠囊對體外培養基質細胞增殖作用的影響 （±s，n=5）

注：與低濃度組比較▲P＜0.01；與中濃度組比較*P＜0.01。

組 別高濃度組中濃度組低濃度組藥物劑量（g/mL）0.066 7 0.006 67 0.000 667 24 h 0.397 9±0.019▲*0.116 9±0.013▲0.074 2±0.009 48 h 0.619 2±0.039▲*0.129 3±0.008▲0.090 7±0.025 72 h 0.943 8±0.010▲*0.302 6±0.024▲0.115 8±0.010

2.2 不同濃度組藥液對TGF-β1mRNA 表達的影響

前列腺基質細胞中的TGF-β1mRNA 表達隨著前癃通膠囊（藥液）濃度的增高呈現下降趨勢。TGFβ1mRNA 在高濃度組的表達最低，空白組的表達最高。高、中、低濃度組分別與空白組比較差異有統計學意義 （P＜0.01）；高、中濃度組與低濃度組比較TGF-β1mRNA 的表達明顯減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表2。

表2 不同濃度前癃通干預下TGF-β1mRNA表達情況 （±s，n=5）

表2 不同濃度前癃通干預下TGF-β1mRNA表達情況 （±s，n=5）

注：與空白組比較▲P＜0.01；與低濃度組比較*P＜0.01。

組 別高濃度組中濃度組低濃度組空白組藥物劑量（g/mL）0.667 0.333 0.167—TGF-β1mRNA 0.3998±0.041▲*0.4785±0.035▲*0.5940±0.050▲0.7289±0.023

3 討論

TGF-β1 是調節前列腺基質細胞增殖和分化的重要生長因子，是促進BPH 的重要因素[7]。有研究表明，在前列腺組織內TGF-β1 是一種強有力的細胞生長調節物質，由基質細胞分泌，其受體存在于基質細胞和上皮細胞表面，通過自分泌、旁分泌方式抑制細胞增殖和促進細胞凋亡[8]。TGF-β1mRNA 在增生前列腺組織中呈高水平表達，既可能是TGF-β1 刺激基質細胞增殖導致前列腺增生；也有可能與前列腺組織中存在抗TGF-β1 細胞有關，該細胞的增殖導致了BPH 發生。研究結果提示，不同種濃度的前癃通膠囊都能抑制前列腺基質細胞的增殖，且隨著濃度的增加、時間的延長抑制作用增強；前列腺基質細胞中的TGF-β1mRNA 表達隨著前癃通膠囊（藥液）濃度的增高呈現下降趨勢。進一步說明了前癃通膠囊能通過不同程度降低前列腺基質細胞TGF-β1 的表達，從而抑制前列腺基質細胞的增殖，達到治療前列腺增生的效果。

前癃通膠囊[9-10]是導師賀菊喬教授經過多年的臨床經驗總結出來的治療前列腺增生的經驗方。由黃芪、田三七、王不留行、丹參、紅藤、穿山甲等藥組成。其中重用黃芪為君藥，益氣利水；穿山甲、田三七、丹參、紅藤，活血化瘀，軟堅散結為臣藥；王不留行利尿，活血化瘀為佐藥，以輔助君臣藥益氣利水，活血散瘀。諸藥合用，共奏益氣利水，活血散結之功。現代藥理研究表明：黃芪有增強機體免疫功能，利尿、抗衰老，對包括bcl-2，bux 在內的多種凋亡基因的表達具有調控作用[11]；王不留行可對老年前列腺增生者下丘腦-垂體-性腺軸功能減退有一定改善作用；穿山甲也對包括bcl-2，bux 在內的多種凋亡基因的表達有調控作用。結果提示：前癃通膠囊明顯抑制了細胞生長因子TGF-β1 的表達，而且隨藥物濃度的增加，作用呈增強趨勢，說明益氣活血化瘀之前癃通膠囊抗BPH 的作用之一是通過抑制TGFβ1 過度表達而抑制增生的前列腺組織新生血管形成。前癃通膠囊治療BPH 的其作用機制有待進一步研究。

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