異氟烷麻醉后低體溫對大鼠海馬的影響*

譚文斐，田阿勇，王俊科，曹學照，馬 虹

（中國醫科大學第一醫院 麻醉科，遼寧 沈陽 110001）

Tau蛋白是一種具有生理功能的可溶性蛋白，能夠與微管蛋白結合，在神經元及軸突的生長過程中起著重要作用[1]。在正常海馬記憶神經元形成過程中，tau蛋白至關重要，而在病理改變中，高度磷酸化的tau蛋白起到決定性的作用[2]。當大鼠暴露于應激反應，能夠誘發外周和中樞炎性因子例如，白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的釋放[3]。但是，有關圍術期低體溫引起的海馬的tau蛋白和炎性因子的影響卻知之甚少。全身麻醉藥能夠明顯地損害正常的體溫調節，導致圍術期低體溫[4]。圍術期由麻醉帶來的低體溫對大多數病人是有害的[5]。低體溫雖然沒有引起明顯的神經損害，但是可能帶來認知功能障礙。因此，本研究旨在探討暴露于臨床相關濃度的異氟烷是否導致tau蛋白高度磷酸化以及炎性因子表達的增加。

1 材料和方法

1.1 動物及麻醉方法

135只雄性成年SD大鼠購于中國醫科大學動物實驗中心，6月齡，體重 350～400 g，動物在22～23℃環境中自由活動，12：12 h日夜循環，自由進食水。大鼠吸入異氟烷（百特，美國）麻醉誘導后氣管插管，機械通氣維持異氟烷濃度為1.5%，潮氣量2.5mL，呼吸頻率65～70次/min，混合50%氧氣通氣2 h，麻醉期間暴露于室溫或給予體溫保護。期間監測大鼠心電圖及直腸溫。預實驗結果顯示本實驗方法對心肺功能影響甚微（反映于正常的血氣分析）。大鼠隨機分為3組：健康對照組（group A；n=15）無任何干預措施。麻醉保溫組（group B；n=60），大鼠異氟烷麻醉后利用加溫墊保持體溫在36.0～37.0℃。麻醉低體溫組（group C；n=60），大鼠麻醉后暴露于22℃室溫。麻醉后大鼠自然蘇醒分籠飼養。B，C組大鼠分別于麻醉后2 h即刻、麻醉后1、3、7 d（15只/時點）處死，迅速取出海馬置于-70°C液氮保存，標記為 B0、B1、B3、B7、C0、C1、C3 和 C7。

1.2 蛋白印跡分析

海馬組織用溶解液（5 mM Tris-HCl，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，150mM NaCl，1%NP-40，0.5%Na deoxycholate，0.1%SDS，and protease and phosphatase inhibitors；pH 7.5） 勻漿處理后，以12000 g、4℃條件離心15min。蛋白提取物置入加樣緩沖液（10%SDS，0.1M Tris pH 8.0，50 mM DTT，3 mM EDTA，0.001%bromphenol blue），100℃煮沸5min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜。硝酸纖維濾膜 5%脫脂奶粉的TBST（0.1%Tween 20，20mM Tris-HCl，137 mM NaCl，pH 7.6） 中封閉 2 h 后，分別與一抗兔抗鼠 Tau（phosphor-Thr205）（1∶500，Signalway Antibody，美國），兔抗鼠Tau[（phosphor-Ser396）（1∶500，Signalway Antibody，美國）]及兔抗鼠 Total tau（1∶500，Signalway Antibody，美國）4℃過夜。其后，膜與辣根過氧化物酶結合二抗室溫孵育2 h。最后膜與ECL系統曝光，成像。以每條帶的光密度值（IDV，Integrated Density Value）做為條帶的強度指標，以β-actin的IDV值做為內參照，采用目標條帶IDV與相應的β-actin IDV比值做為指標進行統計學分析[6]。

1.3 磷酸酶活性分析

利用絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶測定系統進行蛋白磷酸酶2A（PP2A）活性測定[6]。大鼠斷頸處死后迅速取海馬，置入磷酸酶樣本緩沖液勻漿，去除顆粒物及內源性磷酸鹽。取2.0μL樣本溶液，在PP2A緩沖液中孵育10min，可以測定化學合成硫酸肽的釋放。磷酸鹽釋放量可以通過630 nm時樣本吸光率測定。通過比較各組與對照組吸光率比值判斷PP2A活性變化。

1.4 實時定量PCR分析IL-1β m RNA和TNF-αmRNA

利用Trizol試劑將總RNA從海馬勻漿液中分離。參照逆轉錄試劑盒（TaRaKa，中國）說明合成cDNA。RNA樣品與gDNA混合42℃孵育2min。逆轉錄緩沖液和引物混合后加入樣品42℃孵育15 min，然后95℃孵育3min。利用Applied Biosystems（Foster，美國）系統進行實時定量PCR。大鼠IL-1β引物：5'-ATCCCAAACAATACCCA-3'，和 5'-CAACTATGTCCCGACCA-3'；TNF-α 引物：5'-CCACGCTC TTCTGTCTACTG-3'和5'-GCTACGGGCTTGTCACT C-3'；3- 磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物：5'-GCA AGTTCAACGGCACA-3'和5'-CATTTGATGTTAGCG GGAT-3'。ABI PRISM 7500HT檢測系統進行熒光測定，以GAPDH為內參照，對循環數（threshold cycle）Ct值計算后進行比較[6]。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 麻醉誘發低體溫

麻醉后可以誘發低體溫，大鼠直腸溫度分別為麻醉即刻，（37.0±1.2）℃；麻醉后 30min，（34.0±1.3）℃；麻醉后 60min，（30.0±1.1）℃；麻醉后 120 min，（27.0±1.2）℃。麻醉復蘇后所有動物體溫均恢復正常。

2.2 低體溫調節麻醉誘導的tau蛋白高度磷酸化

為了檢測室溫下暴露于異氟烷對大鼠腦內tau蛋白磷酸化的影響，本組測試了海馬內tau蛋白兩個位點的磷酸化程度。Thr205位點和Ser396位點與對照組比較分別增加了10倍和2.9倍，但total tau沒有顯著變化（表1）。當麻醉鼠進行保溫處理時，體溫持續在37℃，磷酸化位點恢復到對照組相似水平，total tau仍然沒有變化。這些結果提示，麻醉對于tau蛋白磷酸化的影響并非麻醉本身的作用，而是受低體溫調節。

2.3 麻醉引起的低體溫抑制PP2A

基于先前研究的結果[6]，麻醉期間的tau蛋白磷酸化可以歸結為低體溫對于絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性的直接抑制作用。本組利用PP2A測試試劑系統對于這一內源性脫磷酸化作用進行測試。麻醉保溫組和對照組PP2A活性差異無顯著性；麻醉低體溫組和對照組比較，PP2A活性抑制約45%（表2）。這些數據說明，麻醉期間的tau蛋白磷酸化是低體溫對于磷酸酶活性直接抑制的結果，因為麻醉低體溫組與對照組改變僅僅是因為體溫發生了改變。

2.4 麻醉引起的低體溫誘發炎性反應

與對照組比較，麻醉期間保溫并不增加IL-1β mRNA和TNF-α mRNA的表達。但是，麻醉低體溫組在麻醉后2 h，麻醉后1，3 d，IL-1βmRNA表達分別增加 12.7倍（P＜0.01），17.9倍（P＜0.01）和 2.3倍（P＜0.05）。麻醉期間低體溫組在麻醉后1、3 d，TNF-αmRNA表達同樣增加2.0倍和1.6倍（P＜0.05）。見表 2。

表1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

表1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

注：1）與對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與對照組比較，差異無顯著性，P＜0.01

組別 Total tau phosphor-Thr205 phosphor-Ser396 A 1.08±0.20 1.10±0.20 0.92±0.20 B0 1.08±0.20 0.96±0.10 1.06±0.20 C0 1.14±0.10 12.26±0.802） 4.16±0.201）B1 0.94±0.20 1.18±0.20 0.98±0.20 B3 1.16±0.10 1.00±0.30 0.84±0.10 B7 0.96±0.30 1.14±0.20 1.18±0.10 C1 1.14±0.10 1.08±0.10 1.02±0.20 C3 1.07±0.10 1.04±0.20 0.84±0.10 C7 1.2±0.10 1.10±0.30 0.86±0.10

圖1 麻醉后低體溫誘導的tau蛋白高度磷酸化（%，，n=5）

圖2 Real-time PCR反應溶解曲線及擴增曲線

表2 麻醉后低體溫對蛋白磷酸酶活性和炎性因子的影響（%，，n=5）

表2 麻醉后低體溫對蛋白磷酸酶活性和炎性因子的影響（%，，n=5）

注：1）與對照組比較，差異有顯著性，P＜0.05；2）與對照組比較，差異無顯著性，P＜0.01

組別 PP2A IL-1βmRNA TNF-αmRNA A 1.03±0.06 1.01±0.30 1.02±0.20 B0 1.13±0.06 1.30±0.10 1.34±0.30 C0 0.5±0.031） 12.73±0.602） 1.28±0.40 B1 0.93±0.15 1.26±0.40 1.34±0.30 B3 1.13±0.06 1.44±0.40 1.26±0.30 B7 0.97±0.21 1.40±0.10 1.24±0.20 C1 0.93±0.15 17.86±0.572） 2.02±0.201）C3 1.06±0.15 2.26±0.201） 1.66±0.31 C7 1.00±0.20 1.14±0.20 1.32±0.40

3 討論

本研究探討了異氟烷麻醉大鼠體溫的變化，海馬內tau蛋白的磷酸化以及炎性因子的變化。結果提示1.5%的異氟烷麻醉后可以導致持久的低體溫，抑制PP2A，誘發tau蛋白高度磷酸化。麻醉期間進行體溫保護可以保持磷酸化tau蛋白在正常水平。麻醉期間低體溫可以增加炎性因子IL-1βmRNA和TNF-αmRNA的表達。

已有研究表明異氟烷對于心臟的保護作用[7-8]，還有研究提示，異氟烷麻醉鼠比對照組學習能力更強，體外測試長時程電位提高，海馬神經元NMDA受體NR2B亞單位選擇性上調[9]。異氟烷能夠提高生后60 d鼠空間參考記憶，但在生后7 d的鼠面對恐懼環境和空間參考記憶，會引起海馬相關性的持久損害[10]。最近的幾項研究更加關注異氟烷麻醉對于神經元改變，尤其是對于細胞增殖的影響。新生鼠異氟烷麻醉后立即引起腦細胞的退行性變，但是，對于成年鼠并未觀察到自主運動、，空間記憶學習能力的改變，以及神經元密度的變化[11]。對于幼鼠，異氟烷麻醉后并未觀察到海馬細胞的增殖，麻醉藥物對于細胞抑制的機制并不明確[12]。本研究的重點也并非異氟烷對于海馬功能的直接影響，而是關注異氟烷麻醉后誘發的低體溫引起的海馬內蛋白和炎性因子的變化，而這些變化有可能為尋找麻醉后認知功能變化提供線索。

針對于創傷、危重病人的恢復以及外科操作，低體溫是保護大腦的常用手段。當伴隨有低氧，缺血，炎癥及外傷時，低體溫治療有其特異的效果。尤其在心血管手術中，深低體溫對大腦確有獨特的保護作用。但是，麻醉后誘發的低體溫對于大腦皮層功能潛在的損害一直是有爭議的[13]。

總之，本研究提示，臨床相關劑量的異氟烷麻醉后引起tau蛋白磷酸化水平增加。這種盡管是可逆性的磷酸化的tau蛋白，能夠增加tau不溶性，誘發其聚集，導致tau蛋白從微管解離。而且，神經纖維網及神經元細胞內磷酸化tau蛋白水平增加。所有這些tau病變是海馬內學習記憶改變的病理學基礎。而且，IL-1在皮層神經元的培養液中可以加速神經纖維纏結，說明其在tau病理中至關重要[14]。這些發現提示實驗動物進行體溫保護，可避免海馬內蛋白磷酸化和炎性因子表達增加。而且，麻醉誘發低體溫對于術后認知功能障礙的影響值得深入研究。

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