紫杉醇長循環納米脂質體的抗腫瘤作用

唐 勇，李 堅，張陽德

（中南大學衛生部肝膽腸外科研究中心，湖南 長沙 410008）

紫杉醇是從太平洋紫杉（Tmus brevifolia）的樹皮中分離出來的二萜類抗癌成分，是目前最好的抗腫瘤的天然藥物之一，對卵巢癌、乳腺癌，肺癌、黑色素瘤、腸癌和白血病等有明顯的療效。它作用于腫瘤細胞分裂過程中紡錘體微管蛋白，具有促微管聚合作用，破壞腫瘤細胞的分裂。明顯誘導腫瘤細胞的凋亡。它已被廣泛用于治療卵巢癌、肺癌和乳腺癌等實體腫瘤，也作為多種腫瘤的化療復方藥物之一。紫杉酵的最大缺點是水溶性極低，而且因為肝細胞色素P450代謝酶和消化道p-糖蛋白作用導致口服幾乎不吸收。這些缺陷限制了紫杉醇的臨床應用，也刺激了紫杉醇新制劑的開發研究。近年來各國科學家都在努力探索紫杉醇新型給藥系統（drugdelivery system，DDS），本研究主要觀察紫杉醇長循環脂質體的抗腫瘤作用。

1 材料及方法

1.1 藥物及試劑

紫杉醇注射液（PAC，海口市制藥廠有限公司，國藥準字H10980170），紫杉醇長循環納米脂質體（PAC-LS，國家納米生物技術實驗室采用逆向蒸發法制備，粒徑100 nm，質量濃度1000mg/L），用生理鹽水將PAC及PAC-LS稀釋成500 mg/L備用。DMEM培養基（Life Technologies，Inc），新生牛血清（杭州四季青生物公司），MTT（購自華美生物公司）。另備用制備PAC-LS的脂質（LS，不含化療藥物）5 mg。

1.2 人胰腺癌PANC-1

由本實驗室保存，細胞復蘇后，用含10%新生牛血清的DMEM培養基培養3代以上。細胞在5%二氧化碳及37℃的潮濕環境中單層生長。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 胰腺癌荷瘤鼠模型的準備

實驗小鼠為BALB/C近交系雌性小鼠，5周齡，體重20 g左右，由中南大學實驗動物學部提供，在SPF級條件下飼養。首先準備腫瘤直徑約10mm左右的荷胰腺癌裸鼠8只，引頸處死小鼠，無菌解刨腫瘤，生理鹽水洗凈，游離腫瘤組織并將其切成1～2 mm3的小塊，用套管針直接植入小鼠右側肋部皮下，待腫瘤生長至最大徑約10mm時開始實驗。

1.4 脂質的毒性檢測

取對數生長期PANC-1細胞，胰酶消化稀釋后接種到96孔板，每孔接種90μL含細胞5000個，培養24 h；細胞貼壁后；用生理鹽水配成7個不同濃度的脂質（不含化療藥物）依次加到96孔板上，每孔10μL，終濃度為 100、50、10、2、1、0.1 和 0.01mg/L，每個濃度設5個復孔，每塊板設一組正常對照組（加10μL生理鹽水，不含脂質體）和空白調零孔（只加培養液，不含細胞核脂質體），在培養箱內培養48 h。之后棄去上清液，然后每孔加MTT溶液20μL繼續孵育4 h，終止培養。小心棄去孔內上清，每孔再加入100μL溶解液，振蕩2min，使結晶物充分溶解，測定570 nm OD值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。根據公式OD實驗組/OD對照組計算細胞存活率。

1.5 藥物的體外細胞毒性

同上述單純脂質體毒性檢測方法，使用MTT法進行藥物對細胞抑制實驗，PAC和PAC-LS的終濃度為 10、5、3、1、0.5、0.3 和 0.1mg/L。腫瘤細胞生長抑制率-（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.6 藥物在小鼠體內的抗腫瘤作用

胰腺癌荷瘤小鼠24只，隨機分3組，對照組、PAC和PAC-LS組，在腫瘤生長至直徑約10 mm時，用藥組（PAC和PAC-LS組）小鼠尾靜脈分別注入PAC或PAC-LS，用量為6mg/kg，并開始每隔1天測腫瘤最大徑（a）及垂直徑（b），同時觀測小鼠皮毛的改變。測量者對小鼠用藥內容不詳。觀測截止時間60 d。計算指標：①根據公式V=ab2/2計算腫瘤體積，并與對照組相比較求出差值，得出腫瘤生長延遲時間（tumor growth delay，TGD）；②小鼠生存時間。

1.7 荷瘤鼠腫瘤細胞用藥后細胞周期分布

胰腺癌荷瘤鼠70只，分別尾靜脈注入PAC或PAC-LS，劑量仍為 6mg/kg，在用藥后 0、1、2、4、6、8和24 h等不同時間點上處死5只小鼠。取腫瘤組織，送流式檢測。

1.8 統計學處理

使用SPSS 13.0統計軟件包，采用析因設計的方差分析對結果進行統計學處理，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 脂質體的細胞毒性

脂質原料加入PANC-1細胞培養基后，所有培養基中的PANC-1細胞的增殖率要高于對照組，且隨著脂質體濃度的增加而上升，實驗中最大脂質體質量濃度（100mg/L）的腫瘤細胞增殖率（292%）是最小質量濃度的脂質體（0.01mg/L）的1.7倍（171%）。提示脂質體在體外對細胞無毒性作用。

2.2 PAC和PAC-LS對PANC-1細胞株的毒性比較

以PAC和PAC-LS對人胰腺癌PANC-1細胞株的抑制率為縱坐標，以藥物濃度為橫坐標，得到藥物濃度效應曲線圖（圖1）。可見，PAC和PAC-LS對PANC-1細胞活性的抑制隨濃度的增高出現交叉點。藥物質量濃度在4 mg/L以下時，同一濃度PAC-LS對PANC-1細胞活性的抑制大于PAC，兩者比較差異有高度顯著性（P＜0.01）；藥物質量濃度在4mg/L以上時，同一濃度PAC-LS對PANC-1細胞活性的抑制小于PAC，差異無顯著性（P＞0.05）。PAC和PAC-LS對胰腺癌PANC-1細胞的半數抑制率（IC50）分別為1.63和3.38mg/L。

圖1 不同藥物濃度對PANC-1細胞株的抑制作用

2.3 PAC和PAC-LS對胰腺癌腫瘤生長的影響

胰腺癌荷瘤小鼠尾靜脈注射PAC和PAC-LS后，以用藥后時間為橫坐標，腫瘤體積大小為縱坐標作腫瘤生長曲線圖（圖2），顯示PAC和PAC-LS腫瘤體積生長的速度比對照組緩慢，PAC-LS組又比PAC組腫瘤生長緩慢，對3組的腫瘤生長為原來5倍所需時間進行統計，差異有顯著性（P＜0.01），見表1。PAC-LS組的TGD明顯大于PAC組，2組比較差異有顯著性（P＜0.01），提示PAC-LS能延緩局部腫瘤的生長。

2.4 PAC和PAC-LS對胰腺癌荷瘤小鼠生存期的影響

尾靜脈用藥后，PAC-LS組胰腺癌荷瘤鼠生存時間明顯長于對照組和PAC組，差異有顯著性（P＜0.01），見表l及圖3；但PAC組荷瘤小鼠的生存時間略短于對照組，2組比較差異無顯著性（P＞0.05）。實驗過程中觀察到PAC組小鼠較多出現消瘦和皮毛失去光澤的現象，而PAC-LS組較少發生這種情況。

圖2 胰腺癌荷瘤鼠腫瘤生長曲線

2.5 用藥胰腺癌組織細胞周期分布及凋亡的比較

胰腺癌荷瘤鼠尾靜脈用藥后不同時間應用流式細胞儀對腫瘤組織進行細胞周期分布及凋亡情況檢測，結果顯示，PAC-LS組與PAC組G0和G1期腫瘤細胞分布及細胞凋亡占總細胞數的比例在24 h內基本相似，PAC-LS組的G2和M期占細胞周期比例略低于PAC組，但這種差異無顯著性（P＞0.05），見表2。

表1 胰腺癌荷瘤小鼠用藥后腫瘸生長延緩時間對比和小鼠生存時間的比較 （）

表1 胰腺癌荷瘤小鼠用藥后腫瘸生長延緩時間對比和小鼠生存時間的比較 （）

組別 t5v/d TGD/d 平均生存時間對照組 7.13±2.15 27.94±4.88 PAC 11.49±3.68 4.12±1.61 26.13±3.94 PAC-LS 19.24±4.65 13.55±5.24 48.84±6.19

表2 各組藥物作用后細胞各期分布及凋亡情況 %

圖3 胰腺癌荷瘤小鼠生存曲線圖

3 討論

脂質體（liposomes）是將脂質（如磷脂、膽固醇）等在水中再分散時形成脂質雙分子層膜小泡.將藥物包封入類脂雙分子層形成的超微球體。它通過外層類似細胞的雙層磷脂膜與人體細胞發生吸附、融合、脂交換和內吞等相互作用，將脂質體內包封的藥物導入細胞中發揮作用. 是繼第1代普通丸劑、片劑、膠囊劑等，第2代緩釋制劑和前體藥物，第3代控釋制劑而發展來的第4代靶向制劑。英國BANGHAN等早在1970年就獲得了脂質體，但是直到RAHMAN等人將脂質體作為藥物載體后，才引起世界各國學者的關注[1-2]。

本研究制備的PAC-LS，希望通過較小的脂質體粒徑（100 nm左右）實現對腫瘤組織的促滲滯留作用（enhanced permeability and retantion，EPR），達到被動靶向作用。同時在表面修飾聚乙二醇（PEG），以逃脫網狀內皮系統的吞噬作用，延長在體內的循環時間[3-4]。對該劑型的藥動實驗，已證實本制劑已達到了長循環被動靶向的效果。

由于紫杉醇在吸收過程中存在生物轉化[5]，多種轉化產物進入血液，在血液循環中藥物的清除極快，紫杉醇在2 h后就已檢測不到，故不宜采用紫杉醇血藥濃度法考察其制劑的吸收情況。研究表明，紫杉醇主要經胃腸易化擴散吸收分布于胃腸道[6]。本實驗結果表明紫杉醇制備成長循環納米脂質體后在胃腸組織分布濃度很高，制劑中的紫杉醇長時間黏附于小腸壁（10～12 h），且不易被排入大腸，而紫杉醇原料藥在小鼠腸道中迅速通過小腸進入大腸（約6 h），并隨大便排出。說明紫杉醇素制備成長循環納米脂質體有較好的胃腸黏附性，可有效延長藥物與胃腸黏膜的接觸時間，從而提高藥物在腸道中的吸收。

紫杉醇體內實驗顯示，用藥組（PAC和PAC-LS）的腫瘤生長均比對照組緩慢，而PAC組腫瘤生長也較PAC-LS組慢。PAC-LS組與PAC組比較，不僅能使荷瘤鼠腫瘤生長緩慢，還可延長荷瘤鼠的生存時間。提示PAC有抗胰腺癌的作用，而PAC-LS抗腫瘤作用好于PAC，這可能與本制劑的長循環被動靶向的特點有關。然而，本實驗中觀察到，PAC組的中位生存期小于對照組，但差異無顯著性。

另外本實驗中還觀察到PAC組小鼠較多出現消瘦和皮毛失去光澤的現象，而PAC-LS組較少發生這種情況。紫杉醇脂質體可降低對動物毒性，已被其他實驗證實[7-8]，故推測荷瘤鼠因普通順鉑的毒性而未獲得延長生存時間的益處。本課題下步計劃將做對正常組織毒性反應實驗，以說明此問題。從細胞周期分布及細胞凋亡占總細胞數比例的數據來看，PAC組的細胞各期和凋亡比例數與PAC-LS組基本一致，提示紫杉醇制成脂質體劑型后，對腫瘤細胞的作用的機制同普通紫杉醇。

綜上所述，本研究所采用的脂質體劑型體外無細胞毒性，包裹紫杉醇所制備的紫杉醇納米脂質體的離體細胞毒性大于普通紫杉醇。與普通紫杉醇相比，可以延緩胰腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及生存時間。總之，本課題應用的紫杉醇長效納米脂質體在提高抗腫瘤療效，提高紫杉醇有效生物利用度，可能有潛在的應用前景。

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