琥珀酰化對水酶法提取大豆蛋白的影響

劉 雯 江連洲，2 李 楊，2 黃 莉

琥珀酰化對水酶法提取大豆蛋白的影響

劉 雯1江連洲1，2李 楊1，2黃 莉1

(東北農業(yè)大學食品學院1，哈爾濱 150030)
(國家大豆工程技術研究中心2，哈爾濱 150030)

大豆蛋白是大豆水酶法的主要副產物，提高大豆蛋白提取率對于更好地實現(xiàn)大豆水酶法副產物的綜合利用意義重大。通過將琥珀酰化與水酶法相結合，研究了加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解時間和改性時間對總蛋白提取率的影響，并利用響應面分析法優(yōu)化出最佳改性工藝參數(shù):加酶量為2．24%，液料比為5．25∶1，琥珀酸酐添加量為5．13%，酶解時間為3．21 h，改性時間為1．64 h。在此條件下的總蛋白提取率為93．01%，多肽提取率為66．02%，與改性前相比分別提高了4．37% 和23．46%。

琥珀酰化 改性 大豆蛋白 水酶法

傳統(tǒng)的植物油制取方法雖然能提取95%以上的油脂，但是提油后油料蛋白會嚴重變性，很難再作為食品或飼料再使用［1］。水酶法是一種新型的非有機溶劑提油技術，受到國內外油脂從業(yè)者和研究機構的廣泛關注。它顯著的優(yōu)勢是作用條件溫和，能耗低，能避免有機溶劑的使用，是“綠色”提油工藝，能同時回收油料中的蛋白質、可溶性糖類、功能性因子等物質［2］。水酶法回收的蛋白含有部分大豆多肽。研究發(fā)現(xiàn)大豆多肽具有多種生理功能，例如，大豆多肽比大豆蛋白更易被消化吸收，抗原性更低，具有促進體內脂肪代謝，肌紅細胞的復原，降低膽固醇，抑制血壓升高，增強免疫力和抗自由基損傷(延緩衰老)等功能［3］。

琥珀酰化是蛋白質化學改性的常用方法，是通過大豆蛋白質分子的親核基團(如氨基、羥基)與琥珀酸酐的親電子基團(如羰基)相互反應，再引入琥珀酸親水基團，在催化劑的作用下繼續(xù)引入長碳鏈親油基團，使大豆蛋白成為具有雙極性基團的高分子表面活性劑［4］。研究結果表明琥珀酰化能夠明顯改善蛋白的功能特性，高度酰化的蛋白質在堿性條件下溶解度會增大，利用琥珀酰化后的蛋白進行酶解能夠顯著地提高多肽提取率［5－11］。

本試驗將琥珀酰化與大豆水酶法相結合，研究了加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解時間和改性時間對總蛋白提取率的影響，并利用響應面分析優(yōu)化出最佳改性工藝參數(shù)，為提高大豆蛋白提取率，更好地實現(xiàn)大豆水酶法副產物的綜合利用，以及開發(fā)出功能性更強的副產物產品提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

琥珀酸酐:國藥集團化學試劑有限公司;Protex－6L堿性蛋白酶:美國杰能科酶制劑公司;大豆:黑龍江農業(yè)科學院培植的墾農47;其他試劑為分析純。

1．2 試驗儀器

PHS－25型數(shù)顯酸度計:杭州奧立龍儀器有限公司;FA2004型電子天平:上海舜宇恒平科學儀器有限公司;XMTD－4000型電熱恒溫水浴鍋:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;SC－3614型低速離心機:安徽中科中佳科學儀器有限公司;JJ－1精密增力電動攪拌機:金壇市雙捷實驗儀器廠;HYP－1 020二十孔消化爐、KDN－04Ш型蛋白質測定儀:上海纖檢儀器有限公司;剖分式雙螺桿擠壓機(干法):東北農業(yè)大學工程學院農產品加工實驗室自制。

1．3 試驗方法

1．3．1 常規(guī)測定

粗蛋白的測定:依據(jù)GB 5009．5—2010。

水分的測定:依據(jù) GB/T 14489．1—2008。

1．3．2 工藝流程:

大豆→膨化→粉碎(過40目篩)→預熱(85℃10 min)→酶解(pH 9．5，50℃)→琥珀酰化→滅酶(100 ℃，10 min)→離心分離(4 500 r/min，20 min)→殘渣→水洗→離心分離(4 500 r/min，20 min)→殘渣

1．3．3 擠壓膨化工藝參數(shù)［12］

模孔孔徑20 mm，物料含水率14．5%，螺桿轉速105 r/min，套筒溫度90℃。

1．3．4 琥珀酰化改性方法

攪拌條件下在酶解液中分多次加入琥珀酸酐。反應過程中以1 mol/L NaOH調節(jié)溶液pH在8．0～8．5范圍，直至反應結束。

1．3．5 多肽得率的測定

取酶解上清液，加入等量的10%的三氯乙酸(TCA)溶液，混合振蕩30 min，然后離心分離20 min(4 000 r/min)，測得上清液可溶性氮。計算公式［三氯乙酸(TCA)可溶性氮法(NSI)］:

式中:N1為在10%TCA中可溶性氮/mg;N2為原料大豆中總氮/mg。

式中:m1為大豆含總蛋白質量/g，m2為酶解提取后殘渣含蛋白質量/g。

1．4 試驗設計

1．4．1 單因素試驗

1．4．1．1 加酶量對水酶法總蛋白提取率的影響

琥珀酸酐添加量為物料的4%，液料比為6∶1，酶解時間為3 h，改性時間為2 h，加酶量分別取物料的1%、1．5%、2%、2．5%、3%，考察反應后總蛋白的提取率。

1．4．1．2 液料比對水酶法總蛋白提取率的影響

琥珀酸酐添加量為物料的4%，酶解時間為3 h，改性時間為 2 h，加酶量 2%，液料比分別為 4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1，考察反應后總蛋白的提取率。

大茉莉 上轎的時候母親告誡我，想讓男人記住家，就奉上茉莉花茶，讓他記住家的味道，想要留住男人的心，就要像……

1．4．1．3 琥珀酸酐添加量對水酶法總蛋白提取率的影響

酶解時間為3 h，改性時間為1 h，加酶量2%，液料比為6∶1，琥珀酸酐添加量分別為物料的2%、3%、4%、5%、6%，考察反應后總蛋白的提取率。

1．4．1．4 酶解時間對水酶法總蛋白提取率的影響

加酶量2%，液料比為6∶1，琥珀酸酐添加量為4%，改性時間為 2 h，酶解時間分別取 1、2、3、4、5 h，考察反應后總蛋白的提取率。

1．4．1．5 改性時間對水酶法總蛋白提取率的影響

加酶量2%，液料比為6∶1，琥珀酸酐添加量為4%，酶解時間為 3 h，改性時間分別取 1、2、3、4、5 h，考察反應后總蛋白的提取率。

1．4．2 響應面設計

在單因素研究的基礎上，選取加酶量、液料比、琥珀酸酐添加量、酶解時間、改性時間5個因素為自變量，以總蛋白提取率為響應值，根據(jù)中心組合設計原理，設計響應面分析試驗(表1)。對試驗結果數(shù)據(jù)采用 Design－Expert 7．0．1軟件進行分析。

表1 響應面試驗因素水平表

2 結果與分析

2．1 單因素試驗分析

2．1．1 加酶量對大豆水酶法總蛋白提取率的影響從圖1可以看出，當質量分數(shù)小于2%時，隨著加酶量的增加，總蛋白提取率顯著增加，當質量分數(shù)大于2%時，總蛋白提取率基本不變。為了在實際生產中節(jié)約成本，加酶量最優(yōu)值初步定為2%。

2．1．2 液料比對大豆水酶法總蛋白提取率的影響

由圖2可知，當液料比小于6∶1時，總蛋白提取率呈上升趨勢，當液料比大于6∶1時，呈下降趨勢。原因可能是，酶解時液料比小于6∶1有利于底物擴散，有利于酶與底物作用，但是水分過多降低則會底物和酶的濃度，不利于酶與底物作用。因此初步確定液料比為6∶1。

圖2 液料比對總蛋白提取率的影響

2．1．3 琥珀酸酐添加量對大豆水酶法總蛋白提取率的影響

由圖3可知，當添加量小于4%時，隨著琥珀酸酐的添加，總蛋白提取率也不斷增加，當添加量大于4%時，總蛋白提取率反而降低。其原因可能是添加琥珀酸酐對蛋白質進行改性，增加了蛋白質的溶解度，有利于蛋白酶解，破壞脂蛋白的結構，使油游離出來，但是添加過多，使改性蛋白的乳化性提高，反而不利于蛋白的提取。所以琥珀酸酐添加量定為4%。

圖3 琥珀酸酐添加量對總蛋白提取率的影響

2．1．4 酶解時間對大豆水酶法總蛋白提取率的影響

從圖4可以看出，酶解時間越長，總蛋白提取率越高，3 h內上升較快，3 h后上升較慢。考慮到能耗、生產周期及防止水解液變質等問題，確定最優(yōu)酶解時間范圍為2．5 ～4．5 h。

圖4 酶解時間對總蛋白提取率的影響

2．1．5 改性時間對水酶法總蛋白提取率的影響

由圖5可知，改性時間前3 h，總蛋白提取率緩慢增長，但是改性時間越長，總蛋白提取率反而降低。原因可能是改性時間越長，蛋白結構不斷發(fā)生變化，乳化性增強，阻礙了酶的作用。所以改性時間范圍定為1．5 ～2．5 h。

圖5 改性時間對總蛋白提取率的影響

2．2 響應面分析

響應面設計方案和試驗結果見表2，利用Design－Expert 7．0．1軟件對試驗結果進行二次回歸分析，計算總蛋白提取率Y的回歸方程并進行方差分析(表3)。總蛋白提取率Y的標準回歸方程為:

表2 響應面設計方案和試驗結果

表3 總蛋白提取率的試驗結果方差分析表

由表2和表3的結果可以看出，所得回歸方程極顯著，且失擬檢驗不顯著，這說明用回歸方程Y擬合5個因素與總蛋白提取率之間的關系是可行的。回歸方程Y的二次項 A2、D2以及交互項中的BC對總蛋白提取率有顯著的影響，其他因素影響不顯著，這表明響應值的變化相當復雜，各個試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系，且5因素之間存在交互作用。對回歸方程進行中心標準化處理，回歸方程Y一次項回歸系數(shù)的絕對值大小依次為B、E、D、A、C，表明5個因素對總蛋白提取率的影響順序均為液料比＞改性時間＞酶解時間＞加酶量＞琥珀酸酐添加量。

圖7是總蛋白提取率的三維曲面。由圖7可知，改性時間、酶解時間、液料比、加酶量、改性物質添加量5個因素的交互作用對總蛋白提取率的影響，應用響應面優(yōu)化分析方法對回歸模型進行分析，可知當加酶量為2．24%，液料比為5．25∶1，琥珀酸酐添加量為5．13%，酶解時間為 3．21 h，改性時間為1．64 h，響應面有最優(yōu)值，總蛋白提取率為(93．81±0．95)%。

2．3 驗證試驗和對比試驗

采用上述優(yōu)化后的工藝條件，即加酶量為2．24%，液料比為 5．25∶1，琥珀酸酐添加量為5．13%，酶解時間為3．21 h，改性時間為1．64 h，進行驗證試驗，測得總蛋白提取率為93．01%，多肽提取率為66．02%，結果與理論預測值誤差在1%以內。這說明采用響應面法優(yōu)化得到的工藝條件參數(shù)準確可靠，按照建立的模型進行預測在實踐中是可行的。與改性工藝條件相比，即加酶量為2．24%，液料比為5．25∶1，酶解時間為 3．21 h，測得的總蛋白提取率為88．64%，多肽提取率為42．56%。

3 結論

3．1 影響總蛋白提取率的因素順序為液料比＞改性時間＞酶解時間＞加酶量＞琥珀酸酐添加量。

3．2 利用響應面分析優(yōu)化出的工藝參數(shù)為:加酶量2．24%，液料比 5．25∶1，琥珀酸酐添加量 5．13%，酶解時間3．2 h，改性時間1．64 h。在該條件下的總蛋白提取率為93．01%，多肽提取率為66．02%，與理論預測值誤差在1%以內，這說明利用本試驗建立的模型的優(yōu)化結果與實際情況吻合。與改性前相比，總蛋白提取率和多肽提取率分別提高了4．37%和23．46%。

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Effect of Succinylation on Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Protein

Liu Wen1Jiang Lianzhou1，2Li Yang1，2Huang Li1
(Food Science College，Northeast Agriculture University1，Harbin 150030)
(National Soybean Engineering Tech－nology Research Center2，Harbin 150030)

Soybean protein is the main by－product of the soybean aqueous enzymatic extraction．To improve the extraction rate of Soybean protein is significant for better integrated utilization of the by－product of the soybean anzyme－assisted aqueous extraction．This experiment combined succinylation with aqueous enzymatic extraction to study the relation between the extraction rate of total protein with the amount of the enzyme，liquid to material ratio，additive amount of succinic anhydride，hydrolysis time and modification time．Response surface analysis method was used to optimize experimental parameters，of which，enzyme additive amount was 2．24%，liquid to material ratio was 5．25∶1，additive amount of succinic anhydride was 5．13%，hydrolysis time was 3．21 h and modification time was 1．64 h．Under the conditions of the above parameters，the total protein extraction rate was 93．01%and the peptide extraction rate was 66．02%，which had improved separately 4．37%and 23．46%than those before modification．

succinylation，modification，soybean protein，aqueous enzymatic extraction

TS224．8

A

1003－0174(2012)02－0014－06

黑龍江省攻關項目(GA09B401－6)

2011－05－16

劉雯，女，1987年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白

江連洲，男，1960年出生，教授，博士生導師，糧食、油脂及植物蛋白工程