eNOs基因T786C多態性與原發性高血壓的關系*

梁蓉王偉

原發性高血壓的發生具有復雜性和多源性，受環境和遺傳因素的共同影響。隨著遺傳學和分子生物學技術的發展，對原發性高血壓的病因研究進入到了分子階段，高血壓發病的基因因素成為國內外研究的熱點，內皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因對血壓調節的作用目前很受關注。本文通過研究eNOs基因T786C多態性與原發性高血壓的相關性，旨在從分子水平探討原發性高血壓的發病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2003年6月—2004年6月入住我院的原發性高血壓患者266例（高血壓組）。其中男135例，女131例，平均年齡（49.89±8.74）歲。所有患者均符合1999 WHO/ISH高血壓診斷標準：在未服用抗高血壓藥的情況下收縮壓≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或（和）舒張壓≥90 mm Hg，且至少3次非同日血壓達到以上標準；或已確診為高血壓且正在服用抗高血壓藥物者。排除繼發性高血壓、凝血功能異常性疾病、血栓性疾病、腦血管疾病、外周血管性疾病、風濕性瓣膜病、先天性心臟病、心肌病及心力衰竭者。同時選取在我院體檢的健康人群100例為對照組，其中男50例，女50例，平均年齡（48.05±8.04）歲，其本人和一級親屬均無原發性高血壓、2型糖尿病、心腦血管病或內分泌代謝疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 所有受試者入院后空腹12 h抽取肘正中靜脈血4 mL，常規測定生化及凝血功能等各項指標。并紀錄其身高、體質量、入院當天血壓、吸煙（每日5支以上，超過5年）史及飲酒（每日飲乙醇50 g以上，超過5年）史。

1.2.2 eNOs基因T786C的PCR擴增 以提取的DNA為模板，根據設計的引物，上游5′-ATGCTCCCACCAGGGCAT CA-3′，下游5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′；用PCR方法進行特異性擴增。PCR反應體系總體積為25μL，其中含模板0.5μL，引物各0.5μL，Buffer F 5μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶 1.25 U。反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環，最后72℃延伸7 min。PCR產物用3%的瓊脂糖電泳測定PCR擴增結果。

1.2.3 eNOs基因T786C的PCR酶切 該反應體系12.7μL，包括Buffer 1.25μL，PCR擴增產物10μL，限制性內切酶NgoM Ⅳ0.2μL，dH2O 1.25μL，37℃水浴8 h，反應終止后，用3%瓊脂糖電泳分析eNOs基因T786C的基因多態性。

1.2.4 eNOS基因T786C基因型分析 受檢者DNA經PCR擴增為237 bp的片段，若此片段存在786T?C位點突變，則產生限制性內切酶NgoMⅣ的切點。酶切后得到大小為204 bp和33 bp的2個片段，為CC型；不含T?C位點突變，酶切后只得到1個大小為237 bp的片段，為TT型；酶切后得到237、204和33 bp3個片段者，為CT型，見圖1。

Figure1 Electrophotogram of eNOsgene T786Cpolymorphism圖1 eNOS基因T786C多態性基因型電泳圖

1.3 統計學處理 資料均采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，2組均數間比較采用t檢驗，多組間的計量資料比較采用單因素方差分析；計數資料采用卡方（χ2）檢驗，采用多因素Logistic回歸分析影響高血壓發病的因素，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組一般資料比較 高血壓組的年齡、收縮壓、舒張壓、體質量指數及有飲酒史者均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；其他指標比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 2組eNOS基因T786C基因型和等位基因頻率比較 2組TT、TC及CC基因型分布和T、C等位基因頻率分布差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。

Table1 Comparison of clinical data between two groups表1 2組一般資料比較

Table 2 Comparison of eNOST786C genotype and allele frequency between two groups表2 2組eNOS基因T786C基因型和等位基因頻率比較例（%）

2.3 不同eNOS基因T786C基因型患者的血壓比較 因CC基因型檢出率過低，故將TC、CC基因型合并為一組，為C等位基因攜帶組。高血壓組患者中C等位基因攜帶者的收縮壓及舒張壓與TT基因型者差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血壓比較（mm Hg，±s）

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血壓比較（mm Hg，±s）

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2.4 影響高血壓的多因素Logistic回歸分析 以有無高血壓（無：0；有：1）為應變量，以年齡、性別（女：0；男：1)、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、纖維蛋白原、吸煙（否：0；是：1）、飲酒（否：0；是：1）、體質量指數、T786C基因型（TT型：0，CC/TC型：1）為自變量進行二元Logistic回歸分析，結果顯示影響高血壓的因素有年齡、性別和體質量指數，見表4。

Table 4 Results of Logistic regression analysison risk factors of EH表4 高血壓影響因素的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

1980年Furchgjott等發現NO作為內皮衍生的舒張因子發揮生物學效應。一氧化氮合酶（NOs）是NO合成的限速因子。在人類基因組有3種不同的基因編碼NOs，分別為內皮型NOs（eNOs）基因、誘導型NOs基因和神經元型NOs基因。它們在不同細胞的刺激下合成NO，發揮不同的作用。血管內皮細胞生成的NO擴散至血管平滑肌細胞和血流中，導致肌肉舒張、血管擴張和血流量增加，對于調節血管的張力和血壓，維持動脈彈性具有重要作用[1]。其中eNOs是結構型NOs在上皮細胞的表達，在NOs基因與高血壓關系的研究中，eNOs基因被予以特別關注。動物實驗研究顯示，該基因對血壓的調節起重要作用[2-3]；抑制NOs可使健康人的血壓升高。eNos基因在人類染色體上定位于7q35-q36區，大小約21 kb，含有26個外顯子和25個內含子。迄今發現在eNOS基因的5′側翼區檢測到3個單核苷酸多態性位點：-1468T/A、-922A/G和-786T/C變異。

國內外許多對T786C基因多態性與原發性高血壓關系的研究結果不同[4]。Nakayama等[5]研究發現T786C突變可以降低啟動子的活性，從而降低eNOS基因轉錄起始過程的效率，使eNOS合成減少，其還發現eNos基因啟動子的T786C突變減少基因的轉錄并與冠狀痙攣性心絞痛及心肌梗死有關。為明確基因轉錄減少的機制，Miyamoto等[6]在Hela細胞純化出特異地與突變等位基因結合的蛋白，這一純化的蛋白被證實是復制蛋白A1（RPA1），其認為在T786C突變中，RPA1通過與突變等位基因結合，從而使eNOs基因轉錄減少。Kajiyama等[7]隨后進行的T786C突變與高血壓關系的研究發現高血壓組與對照組的T786C突變頻率相似。Tsujita等[8]對4 055例日本人研究也未發現高血壓組與正常組的T786C基因型分布不同，3種基因型的血壓水平也未見差異。其同時對轉染-786T及-786C等位基因的牛內皮細胞研究，未發現啟動子活性有顯著不同。后來Hyndman等[9]研究了705例成年男性原發性高血壓患者，發現eNOs的5′-側翼區的T786C變異與EH明顯相關，其認為研究結果的差異可能是不同人種的T786C突變情況不同，白人中C等位基因較普遍。

本研究結果顯示高血壓組與對照組TT、CT、CC基因型分布和T、C等位基因分布差別均無統計學意義，表明T786C基因多態性與高血壓發生無相關性。但進一步將高血壓與危險因素結合起來分析，發現血壓明顯受體質量指數影響。提示C等位基因可能增強了機體對某些環境因素刺激的反應，存在環境-基因相互作用，共同影響血壓的水平。

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