TGF-β1、CTGF基因的過表達與早期糖尿病腎病關系的研究*

于 倩 張 沫 劉德敏

糖尿病腎病（DN）早期處于高功能狀態，腎血流量增加，腎小球濾過率增高，尿微量蛋白正常，病理變化表現為腎小球肥大，系膜基質輕度增寬，腎小球基底膜輕度增厚。這種過程是可逆的，但隨著病程延長，當尿蛋白排泄率超過0.5 g/d時，即為臨床糖尿病腎病期，此過程不可逆，最終發展為終末期腎病，只能依靠腎移植、血液透析和腹膜透析等腎臟替代療法來維持生命，因此積極探索DN的發病機制，在DN早期給予適當及時的干預措施至關重要。在DN發病機制的研究中，由糖基化終末產物介導的轉化生長因子（TGF）-β1/Smad/結締組織生長因子（CTGF）通路最為重要，大量研究表明TGF-β 1和CTGF在腎病進程中起著關鍵作用[1]，但TGF-β1和CTGF基因表達與早期DN的關系還不清楚。本研究旨在探討TGF-β1和CTGF基因表達與糖尿病早期腎臟病變的關系及其作用機制，為臨床DN的早期治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物。清潔級雄性SD大鼠27只，購自天津實驗動物中心，8周齡，體質量250～300 g，平均（281±11）g。實驗期間標準條狀飼料喂養，自由進食、飲水，每籠6～7只，自然晝夜光線，室內通風良好，室溫18℃～22℃，相對濕度40%～70%。（2）主要試劑。鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司），Trizol、逆轉錄試劑盒（北京全式金公司），Real-time PCR試劑盒[大連寶生物（TaKaRa）公司],小鼠抗TGF-β1單克隆抗體、山羊抗CTGF多克隆抗體（Santa Cruz biotechnology），SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司）。（3）主要儀器。德國BIOSEN血糖分析儀，芬蘭Quik read快速分析儀，日立CF-15D冷凍離心機，中國博日Line-Gene K熒光定量PCR儀。

1.2 動物模型的建立與分組 全部動物適應性喂養1周后隨機分為2組：正常對照組（NC）12只，糖尿病組（DM組）15只。將STZ溶于0.1mol/L的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.4），配成2%的溶液。DM組大鼠按40 mg/kg體質量尾靜脈注射STZ，對照組注射枸櫞酸鈉緩沖液。給藥后72 h和第7天尾靜脈取血測隨機血糖，2次血糖均≥16.7 mmol/L為造模成功，共14只成模為DM組。

1.3 標本收集與處理 自成模之日起，每2周測血糖1次。第8周時將大鼠置于單個代謝籠中，收集24 h尿液，記錄尿量，3 000 r/min離心3 min后留取上清于-20℃保存，用于24 h尿微量蛋白（UMA）的測定。第8周末，將全部大鼠稱質量，測血糖，股動脈放血將大鼠處死，留取血標本，3 000 r/min離心5 min后取血清于-20℃凍存，待測血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指標。將大鼠腹腔打開，迅速摘取雙腎，左腎稱質量后迅速放入10%福爾馬林固定，右腎去除包膜后留取腎皮質部分于凍存管中，編號后放入液氮保存，24 h后放入-70℃冰箱中凍存備用，用于Real-time PCR測定。

1.4 實驗方法

1.4.1 生化指標的測定 血糖檢測用葡萄糖氧化酶電極法，BUN、Scr測定用酶法，24 h尿微量蛋白檢測用免疫透射比濁法。

1.4.2 腎臟肥大指數（KI） 用腎質量/體質量（g/kg）比值表示。

1.4.4 腎皮質TGF-β1、CTGFmRNA表達測定 （1）腎皮質總RNA提取。用Trizol按步驟提取大鼠腎皮質總RNA，紫外分光光度計測定每個樣品OD260/OD280比值，結果在1.8～2.0為純度較高，并計算濃度，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。（2）cDNA的合成。以RNA為模板，oligo（dT）為引物，在逆轉錄酶MMLV的催化下合成cDNA。（3）引物合成。根據引物設計原則，應用Primer 6.0軟件設計引物，′用NCBIblast評價，再由上海生工合′成。β′-actin引物上游5-CCCATCTA TGA′GGGTTACGC-3，下游5-TTTAATGT′CACGCACGATTT C-3，擴增產物1′50 bp；TG′F-β1引物上游5-CAACAACG′CAA TCTATGACA-3，下游5-CAAGG′TAACGCCAGGAAT-3，擴增產′物 200 bp′；C TGF引物上游5-TGCCTG′CCATTACAACT G-3，下游5-CACACGGTTCTCACTTCG-3，擴增產物247 bp。（4）Real-time PCR。SYBRGreenⅠ與雙鏈DNA結合后發出熒光，通過檢測反應體系中的SYBRGreenⅠ的熒光強度監測RCR產物的擴增量。反應體系包括12.5μL SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 9.5 μL，總體系為25μL。PCR擴增條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火及延伸30 s，共40個循環；最后生成熔解曲線。目的基因與內參基因擴增閾值的差值，即△Ct值，根據公式2-ΔCt計算出樣品初始模板量進行分析。

1.4.5 免疫組織化學法檢測 固定的腎組織經乙醇逐級脫水，石蠟包埋切片（4μm），用免疫組化SABC法檢測。實驗中TGF-β1、CTGF蛋白一抗濃度為1∶150，用PBS代替一抗做陰性對照，4℃孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染。結果分析參考文獻[2]，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統對圖像進行分析,每張切片隨機讀取10個不重疊的視野，計算其積分光密度（IOD），取其均值進行統計學分析。

1.5 統計學分析 應用SPSS17.0統計軟件做數據分析。所有資料均進行正態性檢驗，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布資料以中位數（四分位數間距）表示，2組間比較采用Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物成模情況及體征觀察 DM組大鼠于造模3 d后出現多飲、多食、多尿癥狀，常伴有腹瀉，毛發干枯發黃，隨時間的推移體質量明顯減輕，活動量減少，精神萎靡。NC組大鼠皮毛光滑、毛色正常，體質量隨周齡增加而增加，精神狀況佳，飲食、飲水正常，尿淡黃色，大便顆粒狀。實驗期間NC組大鼠無死亡，DM組死亡2只，主要集中在造模后2周。

2.2 實驗室檢查結果 前4周時，與NC組相比，DM組血糖明顯升高（P<0.01）；6周后，DM組血糖略有降低，但仍明顯高于NC組，見表1。與NC組相比，DM組血肌酐明顯下降，血尿素氮明顯升高（均P<0.01），見表2。與NC組相比，DM組24 h尿量升高明顯，24 h UMA、腎肥大指數也明顯增高，差異均有統計學意義（P<0.01），見表2。

與NC組相比，DM組TGF-β1、CTGF mRNA水平明顯升高（P<0.01），見表3。

免疫組化結果顯示，NC組腎臟TGF-β1在腎小球輕度染色，DM組腎小球著色明顯增多增深，蛋白表達較NC組高（P<0.01）；NC組腎小球未見明顯著色，而DM組大鼠腎小球CTGF表達增多著色明顯，差異有統計學意義（P<0.01），見表3，圖1、2。

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各組大鼠不同周齡血糖比較 （n=12，mmol/L，±s）

**P<0.01；表2、3同

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Table 2 Comparison of correlation index of renal function between rat groups表2 各組大鼠腎功能相關指標比較 （n=12）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達水平（n=12，±s）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠腎皮質TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表達水平（n=12，±s）

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Figure1 Resultsof nephridialtissue TGF-β1 detected by immunohistochemistry圖1 腎組織TGF-β1免疫組化結果（SABC法×400，箭頭所示為陽性棕色顆粒沉著）

Figure2 Resultsof nephridialtissue CTGFdetected by immunohistochemistry圖2 CTGF腎組織免疫組化結果（SABC法×400，箭頭所示為陽性棕色顆粒沉著）

3 討論

3.1 糖尿病腎病大鼠模型的建立 目前，STZ誘導建立的DM模型廣泛應用于DN發病機制和治療方法的研究。STZ通過選擇性抑制β細胞O-乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase）的活性，從而抑制O-乙酰葡萄糖胺的降解，使β細胞內蛋白質不可逆地糖基化，導致β細胞死亡。高劑量注射STZ使胰島素分泌嚴重受損，模擬了1型糖尿病；而低劑量STZ使胰島素分泌輕度受損，具有2型糖尿病后期的特征[3]。近來研究發現，采用單側腎臟切除或單側腎臟結扎后再小劑量注射STZ，也可以成功建立DN模型，但是由于難于分辨單側腎損傷和STZ誘導高血糖對腎小球血流動力學改變的作用，該模型的應用價值尚待討論[4]。無論從腎臟生理解剖特點還是DN的發病機制、病理特征等方面，還沒有一種動物模型能完全模擬人類的糖尿病腎臟損害，應根據研究目的選擇模型的建立方法。本實驗研究早期DN的分子機制及可能的治療方法，因此采用尾靜脈小劑量注射STZ的方法建立DN模型。

3.2 細胞因子與DN TGF-β1是DN病程進展的重要細胞因子，是導致細胞外基質（ECM）過度沉積的關鍵因子，通過TGF-β/Smad通路與靶基因的啟動子區域結合，調控其轉錄[5]，其中CTGF是其主要的效應因子，與TGF-β1共同參與腎臟肥大、系膜基質擴張、膠原增加和纖維黏連蛋白mRNA的表達等作用。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，能與多種細胞因子相互作用，在維持細胞外基質的動態平衡中發揮了重要作用[6]。CTGF通過vWC結構域與TGF-β1結合，從而加強TGF-β1與相應受體的結合，提高了TGF-β1的有效濃度，同時還參與調節其信號轉導。研究顯示，在CTGF基因缺失或基因敲除的細胞中，由TGF-β1介導的30%的基因都失去了對它的反應[7]。TGF-β1功能的實現離不開CTGF,只有當兩者協調作用時，才能促使發生持續的纖維化反應[8]。

3.3 糖尿病腎病標志物 在腎臟疾病中，特別是DN，UMA可以預示腎功能的損害程度，與腎病的進程密切相關。李世芬等[4]通過檢測STZ誘導的DN大鼠的24 h尿蛋白排出量發現，模型組在造模1周時就明顯升高，提示此時就已經存在腎功能的損害，并且排出量隨著病程的延長而增多。但是，近來研究發現腎小球及腎小管損傷引起的細胞內蛋白質的變化要早于尿蛋白的出現[9]，UMA用于診斷DN的進程具有較高的靈敏度，但是特異度較低。

DN早期病理生理改變主要是高濾過和微量蛋白尿，隨后出現腎功能進一步損害。本研究DM組大鼠的病變處于糖尿病腎病早期，DM組CTGF mRNA及蛋白表達較NC組明顯升高，說明CTGF表達在腎病早期即有增加。有研究顯示，與正常蛋白尿的DN患者比較，微量蛋白尿組的DN患者尿中的CTGF高出10倍，大量蛋白尿組高出100倍[10]。Je?rums等[11]研究表明，CTGF陽性細胞數及尿CTGF與腎組織活檢纖維化評分呈正相關。這些結果提示通過檢測CTGF來評價腎臟損傷將具有更好的特異性，有研究者提出聯合應用CTGF與UMA來區分大血管損傷性疾病和腎臟疾病[12]，這對DN的早期診斷將更有意義。

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