冬凌草甲素抑制體內外卵巢癌生長的作用

胡瑞華 王 燕 李紅英 周利敏 謝麗微

目前卵巢惡性腫瘤的發病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第3位，卵巢癌患者的5年生存率僅為40%左右，化療在卵巢癌治療中發揮著舉足輕重的作用，但由于腫瘤細胞對傳統化療藥物的耐藥性，使得傳統化療藥物治療卵巢癌的效果不理想。目前，中醫藥用于惡性腫瘤的治療受到越來越多的關注。冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類天然有機化合物，研究發現冬凌草甲素能抑制胰腺癌[1]、肺癌[2]、前列腺癌[3]和肝癌[4]等多種腫瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡，臨床試驗也證明該化合物對人體重要臟器如骨髓、肝、腎等無明顯損傷[5]，但目前少見有冬凌草甲素對卵巢癌作用的研究報道。本研究擬探討冬凌草甲素對體內外卵巢癌生長的抑制作用，為卵巢癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、RPMI-1640培養基（美國Gibco公司）；MTT試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；核因子（NF）-κB抗體（美國Epitomics公司）；X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）抗體（美國Santa Cruz公司）；免疫組化SP試劑盒（德國寶靈曼公司）；Ki-67抗體（北京中杉金橋生物技術公司）；冬凌草甲素（中國科學院昆明植物研究所）用含30%DMSO(美國Sigma公司)的滅菌三蒸水配成5 mmol·L-1母液，置-20℃保存，應用時加RPMI-1640培養基稀釋成目標濃度（DMSO的終濃度<0.1%，該濃度無明顯細胞毒作用）。

1.2 實驗動物 30只4～6周齡SPF級健康BALB/c雌性裸鼠購自中科院上海實驗動物中心，體質量18～20 g，飼養于SPF屏障系統的潔凈層流架內，控制室溫和濕度。

1.3 細胞培養 人卵巢癌細胞株HO-8910PM購自ATCC，培養在37℃、5%CO2的培養箱中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，生長至70%～80%培養瓶底面積時用胰蛋白酶消化傳代。

1.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的HO-8910PM細胞，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基制備單細胞懸液，以5×103個細胞/孔接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL；過夜至細胞完全貼壁后棄上清，分別加入不同濃度冬凌草甲素（10、20、40 μmol/L），每個濃度設6個復孔；同時設置空白調零組（不加細胞加入等量的0.1%DMSO）及陰性對照組（加細胞加入等量的0.1%DMSO），分別培養24 h；結束培養前4 h每孔加入5 g/L的MTT液10μL后放培養箱繼續培養，終止培養后棄上清，每孔加DMSO 100μL，輕微振蕩10 min，待孔內結晶完全溶解并色素均勻后上酶標儀492 nm檢測各孔光密度（OD）值，計算細胞存活率=（實驗組OD值-空白調零組OD值）/（對照組OD值-空白調零組OD值）×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 采用膜聯蛋白（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染色法。HO-8910PM細胞經冬凌草甲素（40μmol/L）作用24 h后，收集細胞約5×105個，以500μL的結合緩沖液重懸，按試劑盒說明加入5μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5μL PI，混勻后避光，室溫反應15 min，置流式細胞儀測定細胞早期凋亡率。

1.6 Western blot檢測HO-8910PM細胞中NF-κB的表達水平 不同濃度冬凌草甲素（10、20、40μmol/L）作用HO-8910 PM細胞24 h后。抽提蛋白質，取40μg蛋白質經12%十二烷基硫酸鈉（SDS）·聚丙酰胺凝膠電泳分離，電轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）濾膜上，與NF-κB或XIAP一抗室溫孵育3 h，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1 h，漂洗后進行蛋白印跡法檢測，ECL顯色，X線膠片曝光。用Image J分析軟件將每個特異條帶灰度值數字化，以β-肌動蛋白（β-actin）與目的蛋白灰度值的比值作為蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.7 裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立和給藥方案 收集2×107個處于對數生長期的HO-8910PM細胞懸浮于0.2 mL無血清RPMI-1640培養基，注射至每只裸鼠背部皮下，術后裸鼠繼續飼養于SPF實驗室，接種2周后，以皮下瘤體結節直徑>0.5 cm為接種成瘤標準，接種裸鼠的成瘤率為100%。挑選皮下移植瘤直徑為0.5 cm的裸鼠20只，將荷瘤裸鼠隨機分為對照組和實驗組，每組10只，分別灌胃給予0.1%DMSO 0.2 mL/只和冬凌草甲素40 mg/kg，每周一、三、六分別給藥，連續3周。在實驗過程中，2組裸鼠均有少量動物在治療期間出現不同程度腹瀉和稀便表現，但療程結束也隨之停止；實驗過程中，僅對照組裸鼠有1只死于惡液質；接種42 d后，頸椎脫臼處死裸鼠，迅速剪開皮膚，完整剝離腫塊稱質量后計算抑瘤率，抑瘤率=[1-（實驗組開始時平均體質量-結束時平均體質量）/（對照組開始時平均體質量-結束時平均體質量）]×100%

1.8 免疫組織化學法檢測Ki-67、NF-kB和XIAP表達 所有標本均經10%甲醛常規固定、石蠟包埋，5μm厚度連續切片。按照免疫組化SP試劑盒說明書進行免疫組化染色，并以PBS代替一抗作為陰性對照。高倍鏡（×400）下隨機讀取5個視野，每個視野計數200個細胞，計算鏡下陽性細胞所占比例。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對體外卵巢癌HO-8910PM細胞增殖的影響 HO-8910PM細胞經不同濃度（10、20、40μmol·L-1）冬凌草甲素作用24 h后，細胞存活率分別為（80.14±9.84）%、（71.68±6.51）%和（64.58±5.24）%，均低于對照組的（96.12±4.23）%，差異有統計學意義（F=20.565，P<0.05；組間比較P分別為0.001、<0.001、<0.001）。

2.2 冬凌草甲素對卵巢癌HO-8910PM細胞凋亡的影響 冬凌草甲素（40μmol·L-1）作用HO-8910PM細胞24 h后，誘導（15.9±3.4）%的HO-8910PM細胞發生早期凋亡，高于對照組的（1.7±0.3）%，差異有統計學意義（t=9.428，P<0.001），見圖1。

2.3 冬凌草甲素對HO-8910PM細胞中NF-κB和XIAP蛋白表達的影響 NF-κB、XIAP和β-actin的陽性特異性條帶分別為70 ku、53 ku和43 ku，見圖2。3種濃度（10、20、40 μmol·L-1）的冬凌草甲素作用24 h，均可抑制HO-8910PM細胞中NF-κB的表達；而低濃度（10 μmol·L-1）冬凌草甲素對HO-8910PM細胞中XIAP蛋白無明顯抑制作用，高濃度冬凌草甲素（20和40 μmol·L-1）明顯抑制XIAP蛋白的表達，見表1。

2.4 冬凌草甲素對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生長的抑制作用 實驗結束后，對照組腫瘤平均質量為（0.91±0.28）g；實驗組腫瘤平均質量為（0.45±0.16）g，差異有統計學意義（t=3.418，P=0.004）。抑瘤率為56.79%。

2.5 冬凌草甲素對裸鼠腫瘤組織細胞Ki-67、NF-κB和XIAP表達的影響 Ki-67染色陽性細胞表現為胞漿不著色，胞核染成棕褐色，核固縮，染色質濃聚；NF-κB陽性細胞表現為胞漿和胞核為棕褐色；XIAP表達陽性細胞表現為胞漿為棕褐色，見圖3。實驗組中Ki-67、NF-κB和XIAP的表達強度均低于對照組（P<0.05），見表2。

Table 1 Relative expression levels of NF-κB and XIAPprotein in HO-8910PM cells of different experimental groups表1 各組HO-8910PM細胞中NF-κB和XIAP蛋白的相對表達水平比較 （n=6,±s）

Table 1 Relative expression levels of NF-κB and XIAPprotein in HO-8910PM cells of different experimental groups表1 各組HO-8910PM細胞中NF-κB和XIAP蛋白的相對表達水平比較 （n=6,±s）

**P<0.01

?

Table 2 Expressions of Ki-67,NF-κB and XIAPbetween two groups表2 2組Ki-67、NF-κB和XIAP的表達 （n=10，%）

3 討論

近年來研究表明新型抗腫瘤藥物冬凌草甲素能有效抑制多種惡性腫瘤生長，其抑制腫瘤細胞生長方式以誘導細胞凋亡為主，而對機體無明顯不良反應，沒有明顯的細胞毒性。但以往研究對冬凌草甲素抑制腫瘤生長的作用機制尚不十分明確。本研究表明冬凌草甲素能有效地誘導卵巢癌細胞凋亡，誘導細胞凋亡在冬凌草甲素抑制卵巢癌生長中發揮了一定作用；同時本實驗觀察到冬凌草甲素能有效地抑制卵巢癌皮下移植瘤的生長，并且冬凌草甲素作用后腫瘤組織中細胞增值因子Ki-67陽性表達細胞顯著降低，與體外實驗結果相仿；另外，在本實驗中裸鼠在冬凌草甲素給藥期間僅有輕微不良反應，考慮到本實驗中冬凌草甲素的溶劑DMSO對動物有一定不良反應，對照組實驗動物也出現類似的不良反應，因此可以基本排除冬凌草甲素對本次實驗動物的不良反應，表明冬凌草甲素在對機體無明顯影響的前提下仍可顯著抑制卵巢癌生長，提示冬凌草甲素可作為一種新型抗腫瘤藥應用于卵巢癌的治療。

細胞凋亡是一個非常復雜的生理和病理過程，是細胞主動參與的“自殺”機制，而細胞凋亡的發生取決于凋亡抑制蛋白和促凋亡蛋白的對決。在凋亡抑制蛋白中，近年來受到較大關注的是IAPs（Inhibi?tor of Apoptosis Proteins）家族，XIAP是新發現的一個IAPs家族中最重要的凋亡抑制蛋白，XIAP在大多數的腫瘤細胞株中呈過度表達狀態，XIAP可直接抑制Caspases級聯反應，特別是Caspase-3的激活而抑制細胞凋亡，從而與腫瘤化療耐藥密切相關[7]，抑制XIAP的表達能顯著誘導腫瘤細胞凋亡[8]。在本實驗中，XIAP在體內外卵巢癌中呈高表達，而冬凌草甲素不僅能下調體外卵巢癌HO-8910PM細胞中XIAP的表達，還能顯著抑制體內卵巢癌中XIAP的表達，另外冬凌草甲素還能有效抑制體內外卵巢癌生長，從而表明下調XIAP在冬凌草甲素抑制體內外卵巢癌中發揮了一定作用。

NF-κB為一個轉錄因子蛋白家族，與腫瘤的生長、轉移和血管生長等多種惡性生物學行為有密切聯系，NF-κB可調控一系列凋亡相關基因如IAPs家族等，從而在調控腫瘤細胞耐藥和促進細胞生存中起到關鍵作用[8-9]。因此，抑制NF-κB能有效降低凋亡抑制因子對腫瘤細胞的保護作用，從而有效促進腫瘤細胞凋亡。本實驗中，冬凌草甲素能下調NF-κB及其調控蛋白XIAP在HO-8910PM細胞中及在體內卵巢癌中的表達；且其還能有效抑制體內外卵巢癌生長，表明冬凌草甲素可通過抑制NF-κB及其調控蛋白XIAP等，進而抑制體內外卵巢癌生長。

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