Livin和Caspase-3在喉鱗癌組織中表達的意義及相關性分析

徐 勤 高 珊

喉鱗癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤。腫瘤的發生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致，受細胞內多種因素控制。Livin是一種特殊的細胞凋亡抑制劑，具有抗凋亡特性。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是細胞凋亡過程中的關鍵蛋白酶，被認為是凋亡的執行者。本實驗從蛋白水平探討Livin和Caspase-3這2種蛋白在喉癌組織中的表達水平及其相關性分析，進一步探討其在喉癌發生、發展過程中的變化規律及其與臨床病理特征的關系，為喉癌的預防、預后評估及基因治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院耳鼻咽喉科2008年1月—2010年12月住院手術的62例喉癌患者的喉癌組織標本，所有腫瘤組織均經病理學確診為鱗狀細胞癌，全部病例術前均未行放療、化療，臨床資料完整。喉癌患者中男52例，女10例；年齡42～76歲,中位年齡61歲，其中＜60歲者22例，≥60歲者40例；有淋巴結轉移者26例，無淋巴結轉移者36例（有無淋巴結轉移根據術后病理而定）；病理學分級：G1（高分化）組30例，G2（中分化）組 20 例，G3組（低分化）12 例；臨床分期采用國際抗癌協會 （UICC）2010年公布的TNM分類分期標準：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期34例；聲門上型 40例，聲門型22例；發病前吸煙史（每日＞20支）20年以上者48例，為吸煙組，余14例為對照組。收集30例聲帶息肉患者活檢組織做為對照組，并經病理證實為炎癥或正常黏膜。所有標本取材后常規石蠟包埋，用于后續實驗。

1.2 試劑和儀器耗材 兔抗人Livin單克隆抗體 （武漢博士德BA1743）、兔抗人Caspase-3單克隆抗體 （北京中衫金橋ZA-0420）、辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體 （中杉金橋ZB-2301）、即用型DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術開發有限公司)。顯微鏡（日本OlympusBX40F4）、熒光顯微鏡（日本Olympus）、顯微照相系統（日本 Olympus）。

1.3 方法 采用免疫組織化學SP法進行染色，具體步驟如下：石蠟切片（5μm），常規脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，清除內源性過氧化物酶活性，在微波爐里抗原修復15 min，室溫放置 40 min，PBS沖洗 3次×5 min，小牛血清封閉 10 min，滴加一抗 50 μL（1∶100 工作液）4 ℃過夜，PBS 洗 3次×5 min，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS洗3次×5 min，DAB顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素復染，透明，封片，鏡檢。

1.4 結果判定 Livin、Caspase-3主要表達于細胞漿，部分位于細胞核。實驗以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知喉癌陽性組織切片為陽性對照。以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應，并采用Volm雙評分法進行判定。在染色均勻的腫瘤區，選取5個高倍鏡視野（×200），一方面按陽性細胞百分率（A值） 評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分；一方面按染色強度(B值)評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將染色陽性細胞數（A值）與染色強度（B 值）相加判斷結果：陰性（-）：0 分，弱陽性（+）：1～2 分，中度陽性（++）：3～4 分，強陽性（+++）：5～6 分。

1.5 統計學方法 所有數據結果經Excel數據庫整理，應用SPSS 13.0統計軟件進行分析。等級資料采用秩和檢驗，計數資料采用χ2檢驗。采用 Spearman等級相關分析 Livin和Caspase-3表達的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Livin在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達 在62例喉癌標本中，Livin的陽性表達率為67.74%，高于聲帶息肉組織的6.67%，差異有統計學意義 （Z=3.778，P＜0.01)，見表1，圖1、2。

Table 1 The expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表1 Livin在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達情況例（%）

2.2 Livin與臨床病理指標間的關系 62例喉癌組織中，Livin的表達在淋巴結有無轉移、不同臨床分期及不同分化程度之間的差異有統計學意義 （P＜0.05），在不同臨床分型、有無吸煙史、不同年齡及性別方面的差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

Table 2 The relationships between Livin and Caspase-3 expression and clinical pathological characteristics in laryngeal squamous cell carcinoma表2 Livin和Caspase-3蛋白表達與臨床病理指標間的關系 例（%）

Figure 1 The high expression of Livin in larynx squamous cell carcinoma（SP×200）圖1 Livin蛋白在喉鱗癌組織中的高表達（SP×200）

2.3 Caspase-3在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達情況 在喉癌組織標本中，Caspase-3陽性表達率僅為51.61%，低于聲帶息肉組織的86.67%，差異有統計學意義（Z=2.485，P＜0.05），見表3，圖3、4。

Figure 2 The low expression of Livin in polyp of vocal cord（SP×200）圖2 Livin蛋白在聲帶息肉組織中的低表達（SP×200）

Table 3 Expressions of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma and polyp of vocal cord表3 Caspase-3在喉癌組織、聲帶息肉組織中的表達情況例（%）

Figure 3 The low expression of Caspase-3 in laryngeal squamous cell carcinoma（SP×200）圖3 Caspase-3蛋白在喉鱗癌組織中的低表達（SP×200）

Figure 4 The high expression of Caspsee-3 in polyp of vocal cord（SP×200）圖4 Caspsee-3蛋白在聲帶息肉組中的高表達（SP×200）

2.4 Caspase-3蛋白陽性表達與臨床病理指標間的關系 在62例喉癌組織中，Caspase-3蛋白的表達在淋巴結有無轉移、不同臨床分期及不同分化程度之間的差異有統計學意義（P＜0.05），在不同臨床分型、有無吸煙史、不同年齡及性別方面的差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.5 Livin與Caspase-3的相關性 Livin表達陽性的42例喉癌組織中，Caspase-3陽性20例（47.62%）；Livin表達陰性的20例喉癌組織中，Caspase-3陽性12例（60.00%）。Livin與Caspase-3在喉癌組織中的表達呈負相關（rs=-0.448，P＜0.05）。

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of a apoptosis protein,IAPs）中的成員，于2002年從人類基因組cDNA文庫中克隆獲得。Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4.6 kb，其含有IAPs家族成員所特有的凋亡抑制蛋白重復序列（BIR）和一個羧基端環指結構域（RING結構域）。在正常組織中未見表達及低表達，而在腫瘤組織中高度表達[1]。研究顯示，Livin在多數惡性腫瘤中高表達，如骨肉瘤、結腸癌、膀胱癌等[2-4]。Caspase蛋白酶家族即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，是包括人類在內的哺乳動物細胞凋亡的關鍵酶類。Caspase-3是Caspase家族成員中最重要的效應因子，處于凋亡有序級聯反應的下游，大多數觸發細胞的因素最終均需要通過Caspase-3介導信號傳導途徑而導致細胞凋亡[5]。Caspase-3廣泛表達于正常人體組織和多種腫瘤組織中。已有研究顯示，Caspase-3在腫瘤中的表達較正常組織明顯降低[6-7]。Livin和Caspase-3均作為凋亡通路中的重要作用蛋白，Livin抑制細胞凋亡的機制有：在抑制Caspase介導的凋亡途徑中，Livin可以直接抑制核心蛋白Caspase-3的活性，阻斷其級聯反應，從而抑制凋亡進程[8]。其含有BIR2功能區的凋亡抑制蛋白具有與Caspase-3直接結合的功能，而抑制其凋亡活性；還可與Caspase-7、Caspase-9結合阻礙多種途徑誘導的細胞凋亡；還可以激活TAK1/JNK1信號傳導途徑發揮抗凋亡作用。Crnkovic-Mertens等[9]利用siRNA技術干擾宮頸癌Hela細胞中內源性Livin的表達，發現內源性Livin的表達受到干擾后，可有效抑制Hela細胞生長，并且在凋亡過程中發揮了重要的作用。同樣，其他一些實驗結果表明在肺癌、胃腸癌、乳腺癌患者血清中檢測到抗Livin抗體，而且在腫瘤壞死轉移灶中發現帶有Livin特異性的CD4+與CD8+T細胞浸潤，這些現象又從側面提示Livin可能既參與惡性腫瘤生長、增殖過程，也可能參與誘導機體產生細胞免疫和體液免疫應答[10-12]。

已有一些研究表明Livin和Caspase-3在細胞癌變過程中的相互作用關系。Liu等[13]研究證實了Livin通過抑制Caspase-3活性而抑制細胞凋亡，從而促進惡性腫瘤生長。隨麗娜[14]通過對口腔白斑及口腔鱗狀細胞癌中Livin和Caspase-3蛋白的表達研究，發現Livin和Caspase-3不僅在口腔白斑組織與口腔鱗狀細胞癌中的表達具有顯著差異，而且Livin和Caspase-3的表達呈負相關。卓賢露等[15]檢測喉鱗狀細胞癌Livin的陽性表達率為70.73%，顯著高于正常組織，同時Livin在喉鱗狀細胞癌中陽性率與淋巴結轉移有關。謝洪等[16]的研究發現Caspase-3在喉鱗狀細胞癌組織中的表達明顯低于正常組織中。本研究結果顯示，喉鱗癌組織中Livin陽性率高于聲帶息肉組織，Caspase-3陽性率低于聲帶息肉組織，與以上文獻報道一致。本研究結果還顯示在淋巴結有無轉移、不同臨床分期及不同分化程度之間，Livin和 Caspase-3的表達差異有統計學意義。Livin與Caspase-3在喉癌組織中表達呈負相關（rs=-0.448）。表明Livin基因可能通過抑制腫瘤細胞凋亡，在喉鱗癌的發生發展過程中起重要作用，Livin的陽性率隨著喉鱗癌的淋巴結轉移陽性率升高而增高，表明Livin對判斷淋巴結轉移具有重要價值。通過多年大量臨床觀察及研究結果表明，淋巴結轉移是影響喉癌預后的最主要因素。不能對其侵襲轉移進行早期準確預測是導致治療失敗和難以客觀評估預后的主要原因，Caspase-3的表達下調可以作為反映惡性腫瘤生物學行為及預后的生物學指標[17]。Elaliz等[18]檢測胃腸道惡性腫瘤及健康對照者血清中抗Livin抗體，認為Livin可能成為新的胃腸道惡性腫瘤檢測抗原。El-Mesallamy等[19]在急性白血病患者治療過程中檢測Livin表達量并進行患者緩解率及預后分析后認為Livin可以作為急性白血病預后判斷指標之一。通過對Livin與Caspase-3關系的進一步研究，幫助人們進一步認識腫瘤轉移的特征，提高對腫瘤臨床分期和預后的判斷水平，以更好地指導治療及監測治療效果。

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