代文、阿托伐他汀和匹格列酮對腎上腺髓質素和補體因子H表達的影響

鐘繼娟 繆 珩

糖尿病腎病（diabeticn ephropathy，DN）是糖尿病晚期最主要的并發癥之一。DN主要表現為腎臟肥大、腎小球及腎小管基底膜增厚、腎小球內高灌注、高跨膜壓并逐漸進展為腎小球細胞外基質增生、腎小球硬化，最終發展為腎功能衰竭[1]，已成為糖尿病患者最主要的死亡原因之一。DN發生發展的危險因素除高血糖之外，還與高血壓、高血脂、胰島素抵抗（IR）等有關。目前常用的治療DN的藥物有代文、阿托伐他汀和匹格列酮，有研究表明這3種藥物均具有獨立于其基本的降壓、降脂、改善IR作用之外的腎臟保護作用[2-5]，但其作用機制尚不明確。本研究采用體外培養的方法，分別觀察3種藥物對高糖條件下培養的大鼠腎臟系膜細胞轉化生長因子（TGF）-β1、纖維連接蛋白（Laminin，LN）、Ⅳ型膠原（Type Ⅳ Collagen，C-Ⅳ）、TGF-β1mRNA、腎上腺髓質素 （adrenomedullin，AM）mRNA以及補體因子H （complement factor H，Cfh）mRNA 表達的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 大鼠腎小球系膜細胞（HBZY-1）購自中國典型培養物保藏中心（武漢大學保藏中心）。RPMI-1640培養基（美國Sigma公司）、胰蛋白酶（美國GIBCO BRL公司），新生胎牛血清 （NCS，杭州四季青公司），4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，美國 Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司）。匹格列酮標準品系恒瑞公司惠贈，TGF-β1酶聯免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（美國 Genzyme公司），LN和C-Ⅳ放免測定試劑盒（上海海軍醫學研究所生物技術中心），Trizol（美國Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制 代文、阿托伐他汀和匹格列酮均用DMSO溶解，然后用不完全RPMI-1640培養基配成0.03 mmol/L母液，-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 細胞培養 （1）將HBZY-1細胞培養于含10%FCS的RPMI-1640培養液中，置37℃、5%CO2培養箱，實驗共分為：低糖對照（5.6 mmol/L，LG）、高糖對照（30 mmol/L，HG）、高糖+代文（10 μmol/L，HD）、高糖+阿托伐他汀（10 μmol/L，HL）、高糖+匹格列酮（10 μmol/L，HP）5 組。（2）細胞傳代 48 h（傳代前每瓶細胞數約5×104/mL，每瓶細胞懸液6 mL），棄去上清液，加入 LG、HG、HD、HL或HP的培養液，置 37℃、5%CO2培養箱繼續培養，干預48 h后分別取細胞上清液分裝于 Eppendorf管，-20 ℃冰箱保存，用于 TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原蛋白測定，并立即提取系膜細胞總RNA用于逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）。

1.2.3 細胞總RNA提取及RT-PCR （1）采用Trizol一步法抽提細胞總RNA，RNA濃度用比色法測定光密度 （OD）值，RNA完整性用甲醛變性膠電泳驗證。（2）用RT-PCR方法半定量測定藥物剌激對體外培養大鼠系膜細胞TGF-β1mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達的影響，以GAPDH為內參照。TGF-β1引物序列：上游 5′-CTTCAGCTCCACAGAG AAGAACTG-3′，下游 5′-CACGATCATGTTGGACAACTGCTC C-3′，產物 298 bp；AM 引物序列：上游 5′-GAAGCTGGTTTC CATCGCCC-3′，下游 5′-TGCCACCCGCACCTATAACC-3′，產物568 bp；Cfh引物序列： 上游 5′-AAGTTATCTGTCCCTCCC T-3′,下游 5′-CATACTCCTGCTTTTGTCTA-3′，產物 256 bp；GAPDH引物序列：上游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATAT TC-3′， 下游 5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，產物196 bp。逆轉錄反應體系為20μL，取RNA樣本4.0μL加入隨機引物及AMV逆轉錄酶3μL進行逆轉錄。以GAPDH檢測陽性的cDNA為模板，用特異性引物擴增cDNA。PCR反應體系為25μL，逆轉錄產物（cDNA）2.0μL，上、下各游引物0.5μL，Taq酶0.4μL進行PCR擴增。取PCR產物10μL在2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）上電泳，用天能GIS-2010數碼凝膠圖像處理系統掃描電泳結果，測定OD值并計算TGF-β1/GAPDH、AM/GAPDH和Cfh/GAPDH的 OD比值。

1.2.4 細胞上清測定 TGF-β1采用ELISA試劑盒，LN和Ⅳ型膠原采用RIA試劑盒，均按說明書操作。

1.3 統計學方法 數據應用SPSS 13.0統計分析軟件處理，計量資料以±s表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3種藥物對TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達的影響 高糖對照組細胞上清TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原的表達顯著高于低糖對照組（均P<0.001）。高糖條件下予以藥物干預后，與高糖對照組比較，HD組、HL組及HP組細胞上清TGF-β1、Ⅳ型膠原、LN的表達顯著下降 （均P<0.001），且HD組作用更明顯，見表1。

Table 1 Effects of TGF-β1,LN,typeⅣ collagen expressions in mesangial cells cultured under high glucose in five groups表1 各組大鼠腎臟系膜細胞TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達水平影響 （n=4，μg/L，±s）

Table 1 Effects of TGF-β1,LN,typeⅣ collagen expressions in mesangial cells cultured under high glucose in five groups表1 各組大鼠腎臟系膜細胞TGF-β1、LN、Ⅳ型膠原表達水平影響 （n=4，μg/L，±s）

**P<0.01

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2.2 3種藥物對 TGF-β1mRNA、AM mRNA和 Cfh mRNA表達的影響 高糖條件下系膜細胞TGF-β1mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA的表達較低糖對照組顯著增高 （均P＜0.001）。應用藥物干預后，TGF-β1mRNA、AM mRNA 和 Cfh mRNA 的表達較高糖對照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），見圖1～3、表2。

Figure 1 The electropherogram of TGF-β1mRNA expression in different groups of mesangial cells圖1 各組大鼠腎臟系膜細胞TGF-β1 mRNA表達電泳圖

Figure 2 The electropherogram of AM mRNA in different groups of mesangial cells圖2 各組大鼠腎臟系膜細胞AM mRNA表達電泳圖

Figure 3 The electropherogram of Cfh mRNA in different groups of mesangial cells圖3 各組大鼠腎臟系膜細胞Cfh mRNA表達電泳圖

Table 2 Comparison of expressions of TGF-β1 mRNA,AM mRNA and Cfh mRNA in different groups of mesangial cells表2 各組大鼠腎臟系膜細胞TGF-β1 mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達水平的比較 （n=4，OD 值，±s）

Table 2 Comparison of expressions of TGF-β1 mRNA,AM mRNA and Cfh mRNA in different groups of mesangial cells表2 各組大鼠腎臟系膜細胞TGF-β1 mRNA、AM mRNA和Cfh mRNA表達水平的比較 （n=4，OD 值，±s）

**P<0.01

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3 討論

DN是糖尿病最主要的慢性并發癥之一，其發病機制復雜，主要包括腎小球系膜細胞的增厚擴張、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的沉積、間質病變和腎小管病變等，其中TGF-β1改變在DN進行性腎小球硬化過程中起著重要作用。臨床資料顯示，除基本的影響因素如糖尿病患者年齡、病程長以及血糖控制情況之外，肥胖、高血壓及高血脂等胰島素抵抗癥候群在DN的發生發展中起到了非常重要的作用[6]。代文、阿托伐他汀和匹格列酮是目前臨床上常用的降壓、降脂及改善IR的藥物，本研究結果顯示這3種藥物均能顯著降低高糖誘導的TGF-β1、LN及Ⅳ型膠原的表達水平，呈現出一定的腎臟保護作用。

AM是一種強有力的血管舒張性多肽，屬降鈣素基因相關肽超家族，廣泛分布于心血管系統、肺以及腎臟中[7]，最主要的作用是通過擴血管、利尿而維持心血管和腎功能穩態。AM在腎小管上皮細胞有拮抗TGF-β1和促ECM沉積的效應，從而抑制腎小球硬化的發展[8]。此外，AM還可抑制血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅱ的釋放，拮抗 AngⅡ的縮血管和平滑肌細胞增殖的作用[9]。本課題組以往研究發現用外源性AM干預時，AngⅡ和TGF-β1的水平下降，提示AM有抑制AngⅡ和TGF-β1的作用，因此DN患者AM合成釋放增多是機體對腎臟的代償性保護作用[10]。Cfh是一種糖蛋白，是補體系統激活中的一個重要的調節因子。近來研究表明Cfh是AM的一種結合蛋白[11]。本課題組以往的研究發現AM對DN具有一定的保護作用，而Cfh可通過增強AM的作用，從而發揮對糖尿病腎臟的保護作用[12]。

腎內腎素-血管緊張素系統 （RAS）活性在DN早期即有所升高，而這一系統在DN的發生發展中扮演著十分重要的角色，過度激活的RAS系統通過促進TGF-β1的表達誘發腎臟病變。高血糖、高循環張力、AngⅡ、糖基化終末產物以及前列腺素類物質等均可以刺激腎臟系膜細胞過度分泌TGF-β1，而TGF-β1又可進一步促進ECM的沉積[13]。目前AngⅡ受體拮抗劑類藥物防治DN的大型臨床研究已經取得了可喜的結果，然而該類藥物的腎臟保護作用機制尚未完全明了。本研究用代文干預高糖培養的大鼠腎臟系膜細胞，結果顯示代文能有效降低高糖誘導的TGF-β1表達，同時LN和Ⅳ型膠原的含量也相應下降，并且伴有AM和Cfh的反應性下降。因此筆者認為，代文的腎臟保護作用可能是由于其抑制TGF-β1的表達并進一步降低ECM的沉積而介導的。

近年的研究發現，他汀類藥物有著廣泛的調脂之外的作用，如抑制細胞增生、促進腫瘤細胞凋亡[14]以及免疫調節等[15]。Kim等[16]報道洛伐他汀能顯著改善鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠的腎小球硬化和白蛋白尿，這種保護作用可能為血脂改善的結果。由于本實驗是體外培養研究，不存在高脂因素的影響，因此筆者認為阿托伐他汀的腎臟保護作用是獨立于其降脂作用之外的，其機制可能是由于其抑制TGF-β1的表達并進一步降低ECM的沉積而介導的。

噻唑烷二酮類（thiazolidinediones，TZDs）是一類新型的胰島素增敏劑，其主要作用是改善IR及相關代謝紊亂。TZDs的靶分子過氧化物酶體增殖活化受體（PPAR）-γ是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族的成員，主要表達于脂肪細胞和脾細胞，在腎臟系膜細胞也有一定數量的表達，在脂肪細胞分化和脂質代謝中起著重要作用。Isshiki等[17]報道TZDs能抑制甘油二酯-蛋白激酶C-胞外信號調節激酶（Diacylglycerol-Protein kinase C-Extracellular signal-regulated kinase，DAG-PKC-ERK） 途徑激活，且指出TGF-β1的表達受蛋白激酶C-胞外信號調節激酶 （Protein kinase C-Extracellular signal-regulated kinase,PKC-ERK）途徑的調控。因此認為，匹格列酮的腎臟保護作用至少部分是由于其抑制TGF-β1的表達并進一步降低ECM的沉積所致。

綜上所述，代文、阿托伐他汀和匹格列酮干預后TGF-β1、AM和Cfh的表達較高糖對照組均顯著下降，機制可能與其抑制TGF-β1的表達并進一步降低LN和Ⅳ型膠原的沉積有關。

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