MMP-9及PTEN在牙齦癌中的表達及意義

李敬東 梁銳英 徐艷麗 李金源

牙齦癌是常見的口腔惡性腫瘤之一，目前牙齦癌的治療以手術切除為主，但常會造成患者顏面部的缺損和畸形[1]。本研究旨在檢測基質金屬蛋白酶（MMP）-9、第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）在牙齦癌中的表達情況，探討其與牙齦癌臨床病理分型間的關系，為牙齦癌的生物學治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月—2011年9月于本院就診的牙齦癌患者33例，其中發生頸淋巴結轉移9例，術后復發7例。依分化程度分為低分化組8例，男4例，女4例，年齡32～73歲，中位年齡為58歲；中分化組10例，男4例，女6例，年齡35～69歲，中位年齡55歲；高分化組15例，男7例，女8例，年齡21～77歲，中位年齡56歲。同期隨機從癌旁的正常牙齦組織中抽取8例（癌旁組織組），男4例，女4例，年齡 37～69歲，中位年齡 52歲。各組性別（χ2=0.439）、年齡（Z=5.306）差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 主要試劑 pv6000兩步法免疫組化試劑盒、DAB Kit顯色試劑盒及Mouse anti-PTEN（ZM-0221，北京中杉金橋生物技術有限公司），Rabbit anti-MMP-9（Matrix Metalloproteinase 2，bs-0397R）（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 方法 將手術所取標本先進行HE染色，確定所取標本的病理性質。免疫組織化學檢測采用SP法染色。所有切片均由2位有經驗的病理科醫生進行雙盲閱片，MMP-9以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達，PTEN以細胞漿和 （或）細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。在Motic Med 6.0軟件系統鏡下采圖，每張切片隨機攝取10個視野，在光鏡下放大400倍，分析其陽性細胞表達的積分光密度（IOD）值，光密度定標值為255。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行處理。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法檢驗。計數資料用率（%）表示，組間比較行卡方檢驗及確切概率法，MMP-9及PTEN之間相關性及其與臨床特征的關系采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-9和PTEN在各組中的病理表達 （1）MMP-9病理表達。癌旁組織組陽性表達者胞漿可見棕黃染色，為弱陽性表達、彌散分布，見圖1。高分化組陽性表達者在胞漿中可見彌散分布的棕黃染色，為弱陽性表達，見圖2。中分化組陽性表達者胞漿廣泛出現較深的棕黃染色，見圖3。低分化組胞漿中出現深棕黃染色，且細胞膜也出現明顯黃染，為強陽性表達，見圖4。（2）PTEN病理表達。癌旁組織組蛋白主要定位在細胞質和細胞核，呈棕黃色、彌散分布，表達強度較高，見圖5。高分化組PTEN陽性表達者棕黃染色在細胞核和細胞質中彌散分布，染色較深，表達為強陽性，見圖6。中分化組陽性表達者在細胞核和細胞質中棕黃染色散在分布，表達為弱陽性，見圖7。低分化組在細胞核和細胞質中均未見棕黃染色，全部為陰性表達，見圖8。

2.2 各組MMP-9和PTEN的陽性表達率及IOD值比較 （1）MMP-9表達情況。癌旁組織組表達比例低于中、低分化組，高分化組低于低分化組，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組IOD值比較，除癌旁組織組和高分化組，高、中分化組間比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各組間均有統計學意義（P＜0.05），見表1。（2）PTEN表達情況。PTEN陽性率癌旁組織組高于中、低分化組，高分化組高于低分化組，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組間IOD值兩兩比較，除癌旁組織與高分化組間差異無統計學意義外，其余各組間差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

Figure 1 Expression of MMP-9 in gingival tissues adjacent to cancer（SP×400）圖1 MMP-9在癌旁牙齦組織中的表達（SP×400）

Figure 2 Expression of MMP-9 in well differentiated gingival cancer（SP×400）圖2 MMP-9在高分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 3 Expression of MMP-9 in moderately differentiated gingival cancer（SP×400）圖3 MMP-9在中分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 4 Expression of MMP-9 in poorly differentiated gingival cancer（SP×400）圖4 MMP-9在低分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 5 Expression of PTEN in gingival tissues adjacent to cancer（SP×400）圖5 PTEN在癌旁牙齦組織中的表達（SP×400）

Figure 6 Expression of PTEN in well differentiated gingival cancer（SP×400）圖6 PTEN在高分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 7 Expression of PTEN in moderately differentiated gingival cancer（SP×400）圖7 PTEN在中分化牙齦癌中的表達（SP×400）

Figure 8 The negative expression of PTEN in poorly differentiated gingival cancer（SP×400）圖8 PTEN在低分化牙齦癌中的陰性表達（SP×400）

2.3 相關性分析結果 MMP-9和PTEN在牙齦癌中的陽性表達呈負相關（rs=-0.949，P<0.05）。MMP-9及PTEN的表達率與性別、年齡均無相關性（P＞0.05）。MMP-9表達與淋巴結轉移及術后復發呈正相關，PTEN的表達與淋巴結轉移和復發呈負相關（P<0.05），見表2。

Table 1 Comparison of expressions of MMP-9 and PTEN between four groups表1 4組MMP-9和PTEN表達情況的比較

Table 2 Correlation between positive expressions of MMP-9 and PTEN and clinical features in patients with gingival cancer表2 牙齦癌患者MMP-9和PTEN表達與各臨床參數之間的相關性

3 討論

研究認為，細胞外基質（ECM）是腫瘤細胞侵襲和轉移的必經通道，基質金屬蛋白酶類(Matrixmetalloproteinases，MMPs)尤其是MMP-9與腫瘤的侵襲和轉移關系最為密切[2-3]。PTEN基因是具有磷酸酶活性的一種重要的抑癌基因，對細胞周期調控起著重要的調節作用。已有研究表明，口腔鱗狀細胞癌中PTEN基因常出現異常表達[4]。但具體關于PTEN在牙齦癌中的表達及其與其他因子之間的關系尚少見報道。本研究顯示，MMP-9在癌旁組織組的表達率低于中、低分化組，且隨著分化程度的降低，表達率呈增高趨勢。雷志敏等[5]在研究MMP-2、MMP-9及腫瘤抑制基因脆性組氨酸三位體（FHIT）在口腔鱗癌組織中的表達發現MMP-9在正常口腔黏膜中的表達率為26.67%，隨分化程度降低，2種蛋白的表達率隨之增高，與本研究結果一致。免疫組化染色結果顯示，低分化組在胞漿和包膜上均呈深棕染色，表明低分化組MMP-9強陽性表達，同時IOD值結果也近一步證實，分化程度越低，IOD值越大。Cupic′等[6]研究證實，MMP-9在腫瘤組織的表達高于良性腫瘤和正常組織。通常腫瘤壞死因子 (TNF)-α可誘導MMP-9合成增加。Hyc等[7]在研究大鼠膝關節細胞時發現，TNF-α作用于MMP-9基因促進其轉錄過程，從而引起MMP-9水平上調。但牙齦癌中造成MMP-9表達增加的具體機制仍有待于進一步研究。

本研究發現PTEN在癌旁組織中的表達率為100%，且隨著分化程度降低，PTEN的表達率也隨之降低，癌旁組織組和高分化組與中低分化類型牙齦癌比較差異有統計學意義，提示隨著牙齦癌分化程度的降低，PTEN陽性表達率有下降的趨勢。目前大多數觀點認為，PTEN通過它的脂質磷酸酶的活性參與細胞凋亡過程，從而可抑制腫瘤的發生[8]。也有研究認為，PTEN基因可能發生突變，導致酶活性急劇下降，致腫瘤細胞惡性增殖能力增強[9]。本研究結果證實，PTEN的陽性表達率隨分化程度降低而降低，表明其可能在牙齦癌的發生發展過程中起著關鍵作用，但PTEN在牙齦癌中如何發揮作用仍需進一步研究證實。

本研究結果顯示，MMP-9的陽性表達與淋巴結轉移和術后復發呈正相關，表明MMP-9的表達增高可能會促進牙齦癌的復發和轉移。另外，PTEN的陽性表達與淋巴結轉移和術后復發呈負相關，表明PTEN陽性表達時患者淋巴結發生轉移和術后復發的概率較低，而陰性表達的患者，更易發生淋巴結轉移，術后較易復發。MMP-9和PTEN呈負相關，提示MMP-9的高表達和PTEN的低表達在牙齦癌的復發和轉移過程中共同發揮作用，但有關其具體作用機制尚有待進一步研究證實。

[1]郭朱明，王順蘭，張詮，等.116例牙齦癌的治療與預后分析[J].癌癥,2008，27(3):307-310.

[2]Liu Z,Li L,Yang Z,etal.Increased expression of MMP-9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J].BMC Cancer,2010,10(9):270.

[3]Yang S,Zhao Z,Wu R,etal.Expression and biological relationship of vascular endothelial growth factor-A and matrix metalloproteinase-9 in gastric carcinoma[J].J Int Med Res,2011,39(6):2076-2085.

[4]Gan YH,Zhang S.PTEN/AKT pathway involved in histone deacetylases inhibitor induced cell growth inhibition and apoptosis of oral squamous cell carcinoma cells[J].Oral Oncol,2009，45(10):150-154.

[5]雷志敏.MMP-2、MMP-9及腫瘤抑制基因FHIT在口腔鱗癌組織中的表達[J].武漢大學學報,2007，28(2):188-191.

[6]Cupic′DF,Tesar EC,Ilijas KM,etal.Expression of matrix metalloproteinase 9 in primary and recurrent breast carcinomas[J].Coll Antropol，2011，35(2):7-10.

[7]Hyc A,Osiecka-Iwan A,Niderla-Bielinska J,etal.Influence of LPS,TNF,TGF-β1 and IL-4 on the expression of MMPs,TIMPs and selected cytokines in rat synovial membranes incubated in vitro[J].Int JMol Med,2011，27(1):127-137.

[8]Ghosh D,Najwa AR,Khan MA,etal.IGF2,IGF binding protein 1,and matrix metalloproteinases 2 and 9 in implantation-stage endometrium following immunoneutralization of vascular endothelial growth factor in the rhesus monkey[J].Reproduction,2011,141(4):501-509.

[9]Ioannidis I,Dimo B,Karameris A,etal.Comparative study of the immunohistochemical expression of metalloproteinases 2,7and 9 between clearly invasive carcinomas and"in situ"trophoblast invasion[J].Neoplasma,2010,57(1):20-28.