銀杏內酯A、B對高膽固醇誘導的PC12細胞膽固醇代謝的影響*

張云莎，馬東明，盧 斌，馬軼文，姜希娟

（1.天津中醫藥大學病理教研室，天津 300193；2.天津中醫藥大學實驗教學部，天津 300193；3.天津市塘沽區婦幼保健院，天津 300451）

近年來，銀杏葉有效單體被廣泛用于防治阿爾茨海默?。ˋD），取得了較好的療效，但其作用機制尚未完全闡明?；谀X膽固醇代謝紊亂在AD發病中發揮著重要作用，或可假定銀杏葉有效單體銀杏內酯A、B能通過調節腦膽固醇代謝起到保護神經元的作用。

前期工作中，筆者建立體外血腦屏障（BBB）環境下PC12細胞的高膽固醇損傷模型，研究發現高膽固醇環境下，PC12細胞內總膽固醇含量增加，而銀杏內酯A（GKA）和銀杏內酯B（GKB）可以有效降低上述模型的細胞總膽固醇含量，其中以30 μmol/L GKA和25 μmol/L的GKB效果最佳[1]?；诖私Y果，本實驗進一步來探討GKA及GKB對PC12細胞內膽固醇代謝關鍵酶的影響，闡釋GKA、GKB防治AD的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞 PC12細胞株（大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤），購于中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。

1.2 藥品及試劑 DMEM培養基（Gibco），胎牛血清（Hyclone），馬血清（Gibco），多聚－L－賴氨酸（Sigma），可溶性膽固醇（Sigma Cat NO.P6282），辛伐他汀（Sigma），銀杏內酯 A（Ginkgolide A，NO.110862）和銀杏內酯 B（Ginkgolide B，NO.110863）標準品購自寶雞貝斯特植物原料有限公司，反轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）二步法試劑盒（ABI），TRIZOL Reagent（Invitrogen），Tris、DEPC（Sigma）。其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器 CO2培養箱（SANYO），超凈化工作臺（日立），IX－70型倒置顯微鏡（Olympus），Universal 16R低溫高速離心機（Beckman）；ABIPrism7000PCR儀（ABI）。

1.4 體外血腦屏障環境下PC12細胞膽固醇損傷模型建立 參照文獻[2]利用Transwell裝置培養腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞，建立BBB體外模型。將BBB置于培養有PC12細胞的6孔板內，然后在Transwell內皮細胞側加入含40 μmol/L終濃度可溶性膽固醇的培養基繼續作用24 h，作為高膽固醇損傷模型[3]。

1.5 實驗分組及干預 對照組（C），普通培養基培養；模型組（M），40 μmol/L 膽固醇處理 24 h,更換正常培養基繼續培養16 h；GKA組，40 μmol/L膽固醇處理24 h,更換含30 μmol/L GKA的培養基繼續培養16 h；GKB組，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含25 μmol/L GKB的培養基繼續培養16 h。

1.6 RT-PCR測定膽固醇代謝相關酶的基因表達采用Trizol試劑盒提取細胞總核糖核酸（RNA）。依試劑盒說明書，采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒和oligod（T）16 引物將總 RNA（0.2μg）反轉錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA）（10 μL體系）。0.5 μL的cDNA產物用作定量PCR擴增的模板。PCR擴增反應采用SYBR Green PCR Master Mix reagent kits試劑盒和特異性引物（見表1）。數據采用 2-ΔΔCT相對定量法分析。

表1 引物種類及引物序列Tab.1 Primer type and primer sequences

1.7 統計學處理 采用SPSS16.0軟件分析，計量資料均以均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時若方差齊則選用LSD檢驗，若方差不齊則選用Tam hane’s T2法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

高膽固醇環境下，調節細胞膽固醇攝入的關鍵物質低密度脂蛋白受體相關蛋白-1（LRP-1）表達降低（P＜0.01）；細胞內膽固醇酯化關鍵酶乙酰膽固醇?；D移酶（ACAT）及膽固醇流出關鍵通道蛋白ATP結合盒轉運子 A1（ABCA1）表達上調（P＜0.05）；膽固醇羥化酶24S-羥化酶（CYP46）的表達無變化。藥物干預后，上調了LRP-1的表達（P＜0.05），但對其他酶的表達無明顯影響。見表2。

3 討論

近年來的研究表明，外周高膽固醇血癥可以影響BBB的通透性引起腦膽固醇水平升高，而且膽固醇代謝通路中的關鍵物質可以直接參與到AD的發生發展過程中。

腦內膽固醇主要由星形膠質細胞合成，由載脂蛋白E經LRP轉運給神經元。一部分游離膽固醇被神經元內質網中的ACAT酯化，ACAT是調節細胞內膽固醇代謝和分布的關鍵成分。另外一部分膽固醇經膽固醇流出調節蛋白（CERP）排出細胞外，構成膽固醇逆向轉運的第一步，其中ABCA1起主要作用；最后腦膽固醇在CYP46的作用下轉化為24S-羥膽固醇，后者能夠通過BBB，由低密度脂蛋白（LDL）轉運至肝臟代謝。

表2 高膽固醇環境下PC12細胞膽固醇代謝關鍵酶的表達及GKA、GKB的影響（n=8）Tab.2 The effects of GKA and GKB on cholesterol metabolism key enzymes in PC12 cells exposed to high cholesterol（n=8）

β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的主要病理學特征。正常腦組織內Aβ的含量取決于合成與清除的速率。Aβ由淀粉樣前體蛋白（APP）加工合成，主要經由腦內皮細胞膜表面的LRP介導，經BBB流出到外周[4]。有研究發現腦組織中Aβ明顯沉積的AD患者，LRP水平下調；上調LRP的表達后，Aβ的沉積減少[5]。Aβ沉積導致神經元的丟失，因此，持續有效的清除Aβ是避免其在腦內沉積的重要機制。靶向LRP的治療已成為防治AD的重要策略之一。

目前研究表明神經元內膽固醇的分布形式影響著Aβ的產生。ACAT在細胞內膽固醇分布中起著關鍵作用，它可能通過調節膽固醇與膽固醇酯的動態平衡而影響Aβ的產生[6]。有研究認為細胞內膽固醇酯含量越高，Aβ的產生越多，反之亦然[7]。Hutter-Paier等[8]在APP轉基因AD小鼠模型中給予ACAT抑制劑后，發現小鼠腦中Aβ沉積減少；進一步的研究表明ACAT可能通過影響APP裂解方式促進Aβ合成，ACAT的活性輕度降低就能產生強烈的抑制Aβ生成作用[9]。

ABCA1是一種膜相關蛋白，主要是利用ATP將膽固醇從細胞膜內層轉移至外層，使其與載脂蛋白結合，從而介導膽固醇的外流。研究表明，ABCA1在載脂蛋白E結合膽固醇的過程中發揮重要作用。過表達ABCA1的小鼠，可增強脂蛋白的轉運，減少Aβ的沉積[10]。而24S-羥膽固醇作為腦膽固醇代謝的最終產物，在腦脊液中的蓄積也發揮著神經毒性作用，引起神經退行性變[11]。24S-羥化酶的活性決定24S-羥膽固醇的濃度，近年來多項研究顯示[12-13]，CYP46基因的多態性與Aβ沉積密切相關。

本研究發現，高膽固醇環境下，PC12細胞高表達了ACAT及ABCA1，低表達了LRP，提示外周高膽固醇血癥可能會影響腦內膽固醇代謝相關酶的表達；給予藥物干預后發現，除LRP水平上調外，其余無明顯改變，提示GKA、GKB可能通過調控LRP的水平，促進Aβ的清除，達到防治AD的作用。

[1]郭茂娟,范英昌,盧 斌,等.銀杏內酯B對高膽固醇誘導的PC12細胞膽固醇含量的影響[J].中國病理生理雜志，2012，28（1）：173－176.

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