人胚胎主動脈血管內皮祖細胞的分離、培養及鑒定

莊乾淑，張文健，葉麗亞，劉虹麟，曹妍婷，成蘭云，丁浩，婁晉寧，劉鵬，李建中

血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類具有自我更新能力，并定向分化為成熟血管內皮細胞的前體細胞。近年的研究表明，外周血中存在一定數量的EPCs，其數量的減少是心血管疾病高發生率與高死亡率的一個獨立預測因素[1-2]。EPCs 在血管損傷后的內皮細胞修復、防止動脈粥樣斑塊的形成中發揮重要的作用[3]。循環中的EPCs 在一定的條件下可向血管損傷區或缺血局部遷移，修復內皮細胞的損傷[4]并促進新生血管的形成和側支循環的建立[5]。因此，EPCs 在心肌梗死、動脈粥樣硬化和糖尿病血管并發癥等疾病的防治作用中受到越來越多的關注。應用 EPCs 細胞修復血管內皮細胞的損傷或促進缺血區新生血管的形成可能成為未來干細胞臨床治療的一種新技術。然而，目前通過密度梯度離心法或免疫磁珠分選等方法從骨髓、外周血和臍血中分離獲得的EPCs 非常有限[6-8]，難以滿足臨床 EPCs 治療的需要。因此，尋找和建立一種安全、高效的人源化EPCs的分離和培養方法，將為EPCs的臨床治療應用提供可能。

在人胚胎發育過程中，早期胚胎血管中存在大量尚未分化成熟的EPCs[9]。因此，本研究探索從人胚胎早期（14周內）的主動脈分離 EPCs，建立體外擴增 EPCs和誘導其分化成為血管內皮細胞的技術方法，為EPCs的臨床治療應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/F12 干粉培養基、明膠、I 型膠原酶和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）均為美國 Sigma公司產品；干細胞專用血清購自德國 Biochrom公司；人表皮細胞生長因子（human epidermal growth factor，hEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和DiI 標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）均為美國 Invitrogen公司產品；小鼠抗人 CD133 抗體、小鼠抗人 CD34 抗體均購自德國 Miltenyi Biotec公司；山羊抗人 VEGFR2 抗體購自美國R&D Systems公司；基質膠購自美國 BD公司；RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒均為美國Promega公司產品。

流式細胞儀為美國 BD公司產品；TSE100 倒置像差顯微鏡和熒光顯微鏡均購自日本 Nikon公司；AlphaImagerTM2200 凝膠成像系統購自美國Form公司。

1.2 方法

1.2.1 人胚胎主動脈 EPCs的分離與培養 人胚胎組織來源干細胞的分離和研究方案經衛生部中日友好醫院醫學倫理委員會審批，并且每個臨床流產胚胎均獲得患者簽署的人胚胎組織捐贈知情同意書。流產 14周齡以內的胎兒在無菌條件下取主動脈，放入 DMEM/F12 培養液中，用鑷子將主動脈血管內膜面翻轉朝外，用動脈夾將血管兩端夾閉，放置在5ml 0.2% I 型膠原酶溶液中，37 ℃ 水浴消化 20 min 后，將主動脈表面細胞吹打下來，用無血清培養基離心洗滌 2 次，細胞懸浮于含有 100μg/ml ECGS、10 ng/ml LIF、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF和5% 干細胞血清的DMEM/F12培養液中[10-11]，接種于2% 明膠包被的T25 培養瓶中。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3 天換液一次。細胞生長匯合后用 0.1% 胰蛋白酶/0.1% EDTA 溶液消化傳代培養。3 代以內的EPCs 用于本實驗研究。

1.2.2 人胚胎 EPCs的鑒定 以成人腎動脈內皮細胞（renal artery endothelial cells，RAEC）作為對照，通過檢測 EPCs的CD133、CD34和VEGFR2的表達進行鑒定。

1.2.2.1 免疫組織化學染色 將人胚胎主動脈和成人腎動脈組織取材后用福爾馬林溶液固定，然后制備石蠟切片。按照標準免疫組織化學染色技術進行人 CD133和vWF的染色。

1.2.2.2 逆轉錄聚合酶鏈反應 應用試劑盒進行細胞總 RNA的提取和逆轉錄。以 β-actin 作為內參照，應用 PCR 方法檢測細胞 CD133、CD34和VEGFR2的表達。所使用的特異引物序列為：人β-actin 上游引物：5' CTCCATCCTGGCCTCGCTGT 3'，下游引物：5' GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3'，產物長度 268 bp；人 CD133 上游引物：5' CAGAG TACAACGCCAAACCA 3'，下游引物：5' AAATCAC GATGAGGGTCAGC 3'，產物長度 245 bp；人 CD34上游引物：5' GCGCTTTGCTTGCTGAGTTT 3'，下游引物：5' GCCATGTTGAGACACAGGGT 3'，產物長度 183 bp；人 VEGFR2 上游引物：5' AACGT GTCACTTTGTGCAAGA 3'，下游引物：5' TTCCAT GAGACGGACTCAGAA 3'，產物長度 229 bp。PCR產物經 2% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察并分析結果。

1.2.2.3 細胞免疫熒光染色 將細胞接種到96 孔板，培養至 80% 匯合，4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，PBS 洗 3 次，0.1% BSA 封閉 15 min后，分別與鼠抗人 CD133（5μg/ml），鼠抗人 CD34（10μg/ml），羊抗人 VEGFR2（10μg/ml）的單克隆抗體 4 ℃ 孵育過夜；PBS 洗 3 次，加入兔抗鼠或驢抗羊的Alexa Fluor488 標記的二抗，室溫孵育30 min；PBS 洗 3 次，加入 4,6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）1μg/ml 復染，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2.4 流式細胞術 制備 EPCs 及RAEC 單細胞懸液，用 0.1% BSA 洗滌 2 次后，分別用鼠抗人 CD133、鼠抗人 CD34和羊抗人 VEGFR2的抗體作為一抗，以兔抗鼠或驢抗羊的Alexa Fluor488 標記的IgG 為二抗進行標記，標記后的細胞經離心洗滌 3 次后，懸浮于0.1% BSA 溶液中，用流式細胞儀檢測細胞熒光強度。

1.2.3 EPCs的誘導分化 為誘導 EPCs 分化為成熟的內皮細胞，使用添加了 20% 胎牛血清、10 ng/ml血管內皮生長因子和100μg/ml ECGS的培養基培養 EPCs，每 3 天換液一次。培養 14 d后收集細胞，利用流式細胞儀分析誘導前后CD133、CD31 及vWF 表達情況和ELISA 方法檢測 ELAM-1的表達變化。

1.2.4 ELISA 方法檢測 ELAM-1的表達 將誘導前后細胞按照 1×104細胞/孔分別接種于96 孔板中，在37 ℃，5% CO2培養箱中培養至匯合狀態。換成含人重組型 TNF-α（1000 U/ml）的培養基，培養 4 h 后，PBS 洗 2 次，將細胞用–20 ℃ 預冷的冰甲醇固定 10 min，PBS 洗 3 次，1% 過氧化氫封閉 10 min，PBS 洗 3 次，再用 5% FCS/0.05% BSA/0.05% Tween 20/PBS 封閉 15 min，PBS洗 3 次，加入 10μg/ml 鼠抗人-ELAM-1 單克隆抗體，室溫孵育 1 h，PBS 洗4 次，加入 HRP 標記的兔抗鼠 IgG 二抗（1∶200 稀釋），室溫孵育30 min。PBS 洗 4 次，TMB 顯色，2 mol/L H2SO4終止反應，于酶標儀 450 nm 檢測吸光度值（OD值）。

圖1 免疫組織化學染色檢測人胚胎主動脈上 CD133和vWF的表達（×200）Figure1 Immunohistochemistry staining for CD133 and vWF on human fetal aorta (×200)

1.2.5 EPCs 體外血管形成能力檢測 將 EPCs接種于基質膠包被 96 孔板，置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養過夜，通過相差顯微鏡觀察管樣結構的形成情況。

1.2.6 攝取 DiI-Ac-LDL的檢測 細胞按照 6×104細胞/孔種于24 孔板，培養 24 h 后，換成含有 DiI-Ac-LDL（10μg/ml）的培養液，37 ℃，5% CO2培養箱中培養過夜。PBS 洗滌后，熒光顯微鏡下觀察細胞攝取 DiI-Ac-LDL的能力。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色比較人胚胎主動脈上CD133和vWF的表達

免疫組織化學染色發現，小于14周齡的人胚胎主動脈內皮僅有少量細胞表達血管內皮細胞的標志 vWF（圖 1A），而大多數細胞都表達 EPCs的特異標志 CD133（圖 1B）。并且，隨胚胎胎齡的增加，vWF 陽性細胞逐漸增多，而 CD133細胞逐漸減少，表明在小于14周齡的人胚胎主動脈內皮層中存在大量 EPCs。在成熟的人腎動脈上，vWF的表達為強陽性（圖 1C），而 CD133的表達為陰性（圖 1D）。

2.2 人胚胎主動脈 EPCs的分離和培養

原代分離的EPCs 培養 24 h 后，可見細胞克隆貼壁，并有細胞向外爬出（圖2A）。培養 7 d 后細胞進入快速增殖階段，細胞呈單層生長，具有接觸抑制的特性（圖 2B）。

2.3 人胚胎主動脈 EPCs的鑒定

RT-PCR（圖 3A）及免疫熒光染色（圖 3B）結果顯示分離培養的細胞表達 EPCs的標志分子

圖2 EPCs的形態（倒置相差顯微鏡×200）Figure2 The morphology of human fetal EPCs cultured in vitro (Inverted phase contrast microscope×200)

CD133、CD34和VEGFR2，而成人腎動脈內皮細胞只表達 CD34和VEGFR2，不表達 CD133。進一步通過流式細胞術分析發現，培養第 2 代的EPCs 中 CD133 陽性細胞占 41.89%，CD34 陽性細胞占 73.03%，VEGFR2 陽性細胞占 50.63%，而成人腎動脈內皮細胞的CD133、CD34和VEGFR2陽性率分別為0.97%、76.89%和71.04%（圖 3C）。這些結果證實所獲得的細胞為內皮祖細胞。

2.4 EPCS 向血管內皮細胞的誘導分化

2.4.1 EPC 分化為內皮細胞的能力 給予VEGF 進行誘導培養 2周后，EPC 表面干細胞標志分子 CD133的表達轉為陰性，表達內皮細胞標志性分子 vWF 及CD31的比例增高（圖 4A，4B），并且 TNF 誘導的內皮細胞功能性分子ELAM-1 表達增強（圖 4C），說明 EPC 分化為成熟內皮細胞。

2.4.2 形成血管樣結構的能力 將 EPCs 接種到基質膠上后可形成血管樣網絡結構，但其形成的管樣結構不成熟，表現為管腔小、管壁厚（圖 5A）。應用 VEGF和血清進行誘導分化后，所形成的管樣結構較為成熟（圖 5B）。

圖3 體外培養 EPCs的鑒定Figure3 Identification of EPCs by the expression of CD133, CD34 and VEGFR2

2.4.3 攝取 DiI-Ac-LDL的能力 EPCs 與DiIAc-LDL 共孵育后，在熒光顯微鏡下可見 EPCs 攝取的DiI-Ac-LDL 分布在胞漿，呈紅色熒光，熒光陽性細胞比例大于90%（圖 6A）。誘導分化后，細胞攝取 DiI-Ac-LDL的能力增強，表現為胞漿內的熒光強度增加（圖 6B）。

3 討論

圖4 EPCs 分化為成熟內皮細胞的檢測Figure4 Differentiation of EPCs into endothelial cells upon induction by VEGF

圖5 VEGF 誘導前（A）后（B）EPCs 成管能力的檢測Figure5 Evaluation of tube formation by EPCs before and after induction on matrigel

圖6 VEGF 誘導前后EPCs 攝取 DiI-ac-LDL的檢測熒光顯微鏡（×400）Figure6 Fluorescence microscopy for uptake DiI-Ac-LDL by EPCs before and after induction with VEGF (×400)

1997年，Asahara等[7]報告：用免疫磁珠方法從外周血中分離得到 EPCs，這些細胞在缺血或VEGF 誘導后，可以分化為成熟的血管內皮細胞，并證實這些細胞可參與血管內皮細胞損傷修復，并參與新生血管的生成。近期的實驗發現，EPCs 在糖尿病[12]、冠心病[13]、腦缺血[14]等缺血性疾病的治療中具有應用價值。然而，外周血中存在的EPCs是非常有限的，難以滿足臨床治療的應用，因此，如何獲得大量、高純度的EPCs是臨床治療應用需要解決的首要問題。本研究從人胚胎主動脈中分離得到 EPCs，并證實這些細胞具有純度高，體外增殖能力強，并具有分化成為成熟血管內皮細胞的能力。

在胚胎血管發育過程中，血管壁的內膜先形成EPCs 細胞，然后分化成為血管內皮細胞。本實驗通過選擇不同胎齡的主動脈通過免疫組織化學染色證實，14周齡的人胚胎主動脈內膜由 EPCs組成，而 14周齡后的主動脈內膜已經部分分化成為血管內皮細胞。因此，本研究的EPCs 細胞從小于14周齡的胚胎主動脈分離。

在分離 EPCs 以前，我們先將主動脈翻轉（內膜翻到外面），并用血管夾夾閉主動脈末端，然后浸泡在膠原酶中消化。這樣可以避免血管外膜細胞的污染，通過控制酶消化時間可以獲得高純度的EPCs。在EPCs 體外培養過程中，我們采用含有bFGF、EGF和ECGS的干細胞血清的培養基促進細胞增殖，同時加入白血病抑制因子（LIF）抑制EPCs 在培養過程中的分化。在這種培養基中，EPCs 快速增殖，通常在第 3 代時可以達到 107數量級的細胞。

EPCs 細胞的鑒定一般采用 CD34+ CD133+VEGFR2+ 共表達來作為EPC的分子標記[3,15]，其中 CD34和VEGFR2只在EPCs和成熟內皮細胞上表達[16]。我們的結果表明，EPCs 在誘導分化成為血管內皮細胞前后都表達 CD34和VEGFR2，而只有 CD133 在EPCs 誘導成為血管內皮細胞后表達明顯降低，表明 CD34和VEGFR2 主要用于區分非內皮類細胞，而 CD133 才是區別內皮細胞和EPC 細胞的特異標志[17]。

文獻[18]報道，VEGF 可以誘導 EPCs 分化成為血管內皮細胞。在我們的實驗中，EPCs 細胞在經過 VEGF 誘導后，EPCs 細胞的特異標志CD133 表達逐漸減少，而成熟內皮細胞的功能指標如 vWF和ELAM-1 表達增加，表明 EPCs 細胞發生了向血管內皮細胞的分化。ELAM-1是成熟內皮細胞的功能性黏附分子，其基礎表達水平很低，在內皮細胞受到刺激時快速表達[19]。因此，我們對VEGF 誘導前后EPCs 上 ELAM-1的表達進行了分析，結果表明誘導后的細胞在給予 TNFα 刺激后出現明顯上調的ELAM-1 表達，其表達水平與成人腎動脈內皮細胞相似。

攝取 Ac-LDL和形成血管樣網絡結構不僅是成熟內皮細胞的功能特性，也是 EPCs的重要功能指標[7-8]。我們的研究發現，胚胎主動脈來源的EPCs 不僅具有攝取 Ac-LDL的能力，而且在基質膠上可形成血管樣網絡結構，當 VEGF 誘導 EPCs細胞向血管內皮細胞分化后，細胞攝取 Ac-LDL和形成血管樣網絡結構的能力都明顯增強。

這些結果表明，人胚胎主動脈是 EPCs的良好來源，所獲得的EPCs 可在體外大量擴增，并且在VEGF的誘導下可以分化為成熟內皮細胞，是干細胞技術治療血管性疾病的一個新的干細胞材料。

[1]Ma ZL, Mai XL, Sun JH, et al.Inhibited atherosclerotic plaque formation by local administration of magnetically labeled endothelial progenitor cells (EPCs) in a rabbit model.Atherosclerosis, 2009,205(1):80-86.

[2]Kawamoto A, Tkebuchava T, Yamaguchi J, et al.Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia.Circulation,2003, 107(3):461-468.

[3]Briasoulis A, Tousoulis D, Antoniades C, et al.The role of endothelial progenitor cells in vascular repair after arterial injury and atherosclerotic plaque development.Cardiovasc Ther, 2010.

[4]Urbich C, Heeschen C, Aicher A, et al.Relevance of monocytic features for neovascularization capacity of circulating endothelial progenitor cells.Circulation, 2003, 108(20):2511-2516.

[5]Asahara T, Masuda H, Takahashi T, et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization.Circ Res, 1999,85(3):221-228.

[6]Benameur T, Tual-Chalot S, Andriantsitohaina R, et al.PPARalpha is essential for microparticle-induced differentiation of mouse bone marrow-derived endothelial progenitor cells and angiogenesis.PLoS One, 2010, 5(8):e12392.

[7]Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science, 1997,275(5302):964-967.

[8]Ahrens I, Domeij H, Topcic D, et al.Successful in vitro expansion and differentiation of cord blood derived CD34+ cells into early endothelial progenitor cells reveals highly differential gene expression.PLoS One, 2011, 6(8):e23210.

[9]Suda T, Takakura N, Oike Y.Hematopoiesis and angiogenesis.Int J Hematol, 2000, 71(2):99-107.

[10]Rehman J, Li J, Orschell CM, et al.Peripheral blood "endothelial progenitor cells" are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors.Circulation, 2003, 107(8):1164-1169.

[11]Caiado F, Carvalho T, Silva F, et al.The role of fibrin E on the modulation of endothelial progenitors adhesion, differentiation and angiogenic growth factor production and the promotion of wound healing.Biomaterials, 2011, 32(29):7096-7105.

[12]Lee MJ，Kim J，Lee KI, et al.Enhancement of wound healing by secretory factors of endothelial precursor cells derived from human embryonic stem cells.Cytotherapy, 2011, 13(2):165-178.

[13]Alev C, Ii M, Asahara T.Endothelial progenitor cells: a novel tool for the therapy of ischemic diseases.Antioxid Redox Signal, 2011,15(4):949-965.

[14]Kocaman SA, Yal??n MR, Ya?c? M, et al.Endothelial progenitor cells(CD34+KDR+) and monocytes may provide the development of good coronary collaterals despite the vascular risk factors and extensive atherosclerosis.Anadolu Kardiyol Derg, 2011, 11(4):290-299.

[15]Yoder MC.Defining human endothelial progenitor cells.J Thromb Haemost, 2009, 7 Suppl 1:49-52.

[16]Eggermann J，Kliche S，Jarmy G, et al.Endothelial progenitor cell culture and differentiation in vitro: a methodological comparison using human umbilical cord blood.Cardiovasc Res, 2003, 58(2):478-486.

[17]Yin AH, Miraglia S, Zanjani ED, et al.AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells.Blood, 1997, 90(12):5002-5012.

[18]Invernici G, Emanueli C, Madeddu P, et al.Human fetal aorta contains vascular progenitor cells capable of inducing vasculogenesis,angiogenesis, and myogenesis in vitro and in a murine model of peripheral ischemia.Am J Pathol, 2007, 170(6):1879-1892.

[19]Grau GE, Mili N, Lou JN, et al.Phenotypic and functional analysis of pulmonary microvascular endothelial cells from patients with acute respiratory distress syndrome.Lab Invest, 1996, 74(4):761-770.