以肽脫甲?；笧榘悬c(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

張麗蓉，趙莉莉，魏玉珍，李秋萍，王莉?qū)帲嗬麕r

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性緩發(fā)型傳染病。結(jié)核病曾在全世界廣泛流行，奪去了數(shù)億人的生命[1]。異煙肼、利福平等藥物的使用一度使得結(jié)核病得到了很好的控制和治療，但近年來AIDS的蔓延和多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使得肺結(jié)核的防控形勢異常嚴(yán)峻，傳統(tǒng)藥物已不能滿足臨床需要[2-7]。因此，亟需加緊新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)。

肽脫甲酰基酶（peptide deformylase，PDF）是原核生物蛋白質(zhì)成熟過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它在蛋白質(zhì)成熟過程中起關(guān)鍵作用，主要功能就是水解原核生物的新生多肽 N 端甲酰甲硫氨酸的甲酰基。若 PDF 發(fā)生突變或缺失，病原微生物則不能生長、繁殖[8]。它在真核生物中并非必需，因此被視為理想的新一代廣譜抗生素藥物篩選分子靶點(diǎn)之一[9-10]。微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物是研制新藥的重要資源之一，天然產(chǎn)物來源的PDF 抑制劑報(bào)道很少[11-13]，這些報(bào)道的天然 PDF 抑制劑結(jié)構(gòu)多為非肽類，其抑酶活性和抗菌活性都相對其他類型的化合物要低，天然來源的結(jié)核分枝桿菌的PDF 抑制劑還未見報(bào)道。本研究通過建立以肽脫甲?；笧榘悬c(diǎn)的高通量篩選模型，期望在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型酶抑制活性和抗菌活性均較好的抑制劑，為開發(fā)有效的新型抗耐藥結(jié)核分枝桿菌藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Veriti 96 well Thermal Cycler PCR 擴(kuò)增儀為美國 ABI公司產(chǎn)品；?KTA pufifierTM10 層析系統(tǒng)為美國 GE Healthcare公司產(chǎn)品；PolarFluostar 多功能熒光檢測儀為德國 BMG公司產(chǎn)品；三肽for-Met-Ala-Ser 為瑞士 Bachem公司產(chǎn)品；Actinonin和Fluorescamin 為美國 Sigma公司產(chǎn)品。

菌株大腸桿菌感受態(tài) DH5α和BL21（DE3）購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司；克隆載體pGEM-T easy 購于美國 Promega公司；表達(dá)載體pET-28a 由本室保存；細(xì)胞 293T、A549和Raw264.7 由本所免疫室惠贈(zèng)；結(jié)核分枝桿菌 H37Rv基因組DNA 由北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所陸宇老師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.2 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用 NdeI和XhoI 對 T-def和pET-28a 進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因片段和線性化的pET-28a。用 T4 連接酶在16 ℃ 連接 20 h，連接后的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-def。并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，然后涂布于含有 50 mg/L 卡那霉素的LB 平板上。37 ℃ 培養(yǎng) 16 h 篩選重組子，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定載體的正確性，并測序驗(yàn)證片段的正確性及插入方向的正確性。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 用構(gòu)建成功的pET-28a-def 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)，接種于50 μg/ml 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5 時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于20 ℃、200 r/min 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。收獲并裂解菌體細(xì)胞，通過 SDS-PAGE蛋白電泳檢測 PDF 在BL21 中的表達(dá)。超聲裂解菌體后的裂解液于4 ℃、15000×g 離心 30 min，上清用 0.45 μm 濾膜過濾。使用 ?KTA 系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行分離純化。

1.2.4 結(jié)核分枝桿菌 PDF 抑制劑篩選模型的建立、優(yōu)化、評(píng)價(jià)及應(yīng)用

1.2.4.1 蛋白活性測定 PDF 水解掉甲?；牡孜?for-Met-Ala-Ser N 端的甲?；?，N 端暴露出游離的NH2，游離 NH2與熒光胺反應(yīng)后所產(chǎn)生的熒光能夠用多功能熒光檢測儀在激發(fā)光 390 nm、發(fā)射光 470 nm下檢測，熒光強(qiáng)度的變化直接反映了酶活性的強(qiáng)弱[14]。反應(yīng)體系的總體積為50 μl，其中含有：20 ng PDF 酶、5 mmol/L 底物、0.06 mg/ml熒光胺。酶和底物用 pH 7.4的HEPES 緩沖液稀釋及配制，反應(yīng) 30 min 后加入熒光胺，繼續(xù)反應(yīng)5 min 后檢測熒光值。

1.2.4.2 篩選樣品處理 取 7ml 新鮮發(fā)酵液用等體積的丙酮抽提，離心，上清用乙酸乙酯萃取，揮干后用 DMSO 溶解。

1.2.4.3 模型的優(yōu)化和評(píng)價(jià) 本研究考察了一系列溫度（15～45 ℃）、酶濃度（10～100 ng）、底物濃度（0.1～30 mmol）以及反應(yīng)時(shí)間（2～30 min）對酶活性測定的影響，選擇最佳反應(yīng)條件，對模型進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)一步考察了 DMSO 濃度以及反應(yīng)體系中各種成分對酶活性的影響。

計(jì)算下列指標(biāo)：

1.2.4.4 孔板的穩(wěn)定性及均一性評(píng)價(jià) 將經(jīng)優(yōu)化的體系于96 孔板中進(jìn)行反應(yīng)，分別設(shè)陰性對照和陽性對照交叉排列，每天進(jìn)行 1 次體系驗(yàn)證，重復(fù) 3 d。

1.2.4.5 樣品篩選 采用終濃度 1 μmol/L的放線酰胺素作為陽性對照，使用 96 孔板進(jìn)行微生物發(fā)酵樣品的篩選。樣品和陽性藥分別與酶在37 ℃ 預(yù)混合 5 min。加入底物反應(yīng) 30 min 后，再加入熒光胺，檢測熒光值大小。酶抑制率計(jì)算公式如下：

酶抑制率%=（F陰性對照均值－F樣品值）/（F陰性對照均值－F陽性對照均值）×100%

計(jì)算出的數(shù)值可能大于100%，表明樣品對PDF 酶的抑制作用強(qiáng)于陽性樣品。

1.2.5 抗恥垢分枝桿菌活性測定 采用平板紙片法（K-B 法）測定抗菌活性，用恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis mc2155）作為檢定菌。將恥垢分枝桿菌按 1.5% 接種于分枝桿菌培養(yǎng)基中，倒平板。將加有樣品的6 mm的紙片貼于平板上，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后測量抑菌圈的大小。采用異煙肼作為陽性對照，可觀察到明顯抑菌圈的被認(rèn)為是陽性樣品。異煙肼：50 μg/紙片；發(fā)酵液樣品：40 μl 發(fā)酵液/紙片。

1.2.6 樣品細(xì)胞毒性的測定 采用 MTT 法[15]來檢測篩選所得的陽性樣品對細(xì)胞存活的影響情況。本實(shí)驗(yàn)測定的細(xì)胞包括人腎上皮細(xì)胞 293T，人肺腺癌細(xì)胞 A549和鼠單核巨噬細(xì)胞 Raw264.7，加入的發(fā)酵液終濃度為0.5%。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：

計(jì)算出的數(shù)值可能大于100%，表明樣品中的組分對細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用，被認(rèn)為沒有細(xì)胞毒性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆以及目的蛋白在BL21 中的表達(dá)和純化

構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng) NdeI和XhoI 雙酶切的電泳結(jié)果與預(yù)期相符，目的DNA 片段與def 基因?qū)嶋H大?。?94 bp）一致。經(jīng) DNA 測序結(jié)果證明，def 基因序列和插入載體的方向均無誤，重組質(zhì)粒pET-28a-def 構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)入 pET-28a-def的BL21菌株經(jīng)過 IPTG的誘導(dǎo)，目的蛋白結(jié)核分枝桿菌PDF 得到大量表達(dá)。蛋白 SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖 1 所示。

2.2 酶活測定及藥物篩選模型的建立、優(yōu)化和評(píng)價(jià)

酶活測定結(jié)果顯示，純化所得到的PDF 酶具有較高的活性，酶與底物反應(yīng)所測得的熒光值能達(dá)到 10000 左右，可用于后續(xù)高通量篩選模型的建立。

圖1 PDF的表達(dá)和純化Figure1 Expression and purification of PDF in E.coli

2.2.1 藥物篩選模型的建立與優(yōu)化 考察了一系列溫度、酶濃度、底物濃度以及反應(yīng)時(shí)間對酶活性測定的影響（圖 2）。反應(yīng)體系經(jīng)優(yōu)化后，酶的最適反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度 37 ℃；反應(yīng)時(shí)間 30 min；PDF 酶量 20 ng；底物 for-Met-Ala-Ser終濃度5 mmol/L。

利用雙倒數(shù)作圖法，將圖 2D 轉(zhuǎn)變?yōu)?/[ν]與1/[S]的直線關(guān)系，如圖 3 所示。從直線與x 軸的截距可以得到 1/Km的絕對值，直線與y 軸的截距可得到 1/Vmax。此圖可直觀的為酶抑制研究提供易于識(shí)別的圖形。計(jì)算即可得：酶被底物飽和時(shí)的最大反應(yīng)速率Vmax=384.62 F/min，以及米氏常數(shù) Km=0.346 mmol/L。

圖2 篩選條件的優(yōu)化（A：反應(yīng)溫度優(yōu)化；B：反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化；C：酶量優(yōu)化；D：底物濃度優(yōu)化）Figure2 Optimization of screening conditions (A: Optimization of reaction temperature; B: Optimization of reaction time; C:Optimization of enzyme concentration; D: Optimization of substrate concentration)

圖3 PDF 米氏常數(shù)的測定Figure3 Curve of Michaelis-Menten equation

圖4 反應(yīng)體系中各成分的影響Figure4 Effect of single component on the assay

2.2.2 藥物篩選模型的評(píng)價(jià)：

⑴反應(yīng)體系中各成分的影響 在反應(yīng)體系中分別加入緩沖液、底物和酶，檢測其對熒光值的影響，結(jié)果見圖 4。計(jì)算該模型的信噪比，S/N=32.41 ＞3，符合篩選模型的要求。

⑵DMSO 濃度對酶活性的影響 反應(yīng)體系中分別加入不同濃度梯度的DMSO，觀察對反應(yīng)體系中酶活性的影響（圖 5）。結(jié)果顯示，DMSO 低于2%時(shí)，對所測定的熒光值的影響可以忽略不計(jì)。所以，本實(shí)驗(yàn)在50 μl 反應(yīng)體系中加入 1 μl的篩選樣品。

⑶孔板穩(wěn)定性和均一性評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 6顯示，數(shù)據(jù)不存在明顯趨勢，無明顯邊緣效應(yīng)。CV陰性對照=3.78%＜20%；CV陽性對照=8.05%＜20%；Z′=0.73 ＞0.4。各項(xiàng)指標(biāo)均符合高通量模型篩選的要求。

2.3 樣品篩選結(jié)果

圖5 DMSO 濃度對酶活性的影響Figure5 Effect of DMSO concentration on enzyme activity

圖6 孔板均一性和穩(wěn)定性（A：橫向排列；B：縱向排列）Figure6 Validation of the screening assay (A: horizontal array; B: vertical array)

共篩選微生物發(fā)酵液樣品 12400 份。同時(shí)進(jìn)行酶活性的篩選和抗恥垢分枝桿菌活性的篩選，將酶水平初篩抑制率大于30%和復(fù)篩抑制率大于50%的樣品定為陽性樣品，抗菌實(shí)驗(yàn)中可觀察到明顯抑菌圈的被認(rèn)為是陽性樣品。經(jīng)過篩選，初篩得到陽性樣品 497個(gè)，占總數(shù)的4%。重復(fù) 3 次得到陽性樣品 33個(gè)，占總數(shù)的0.27%，其中 8個(gè)樣品具有抗恥垢分枝桿菌活性（表1）。

2.4 樣品細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

對最終獲得的8個(gè)陽性樣品分別進(jìn)行了293T、A549和Raw264.7 細(xì)胞毒性的檢測，加入的發(fā)酵液終濃度為0.5%，計(jì)算加入樣品后的細(xì)胞存活率。如表 2 所示，每個(gè)樣品的細(xì)胞毒性有差異，而單個(gè)樣品對不同細(xì)胞的毒性也存在一定的差異性。其中，樣品 I09AA-00657、I10AA-00705和I09AB-02482的毒性較大；I08AA-01782、I09AA-02493、I09AB-00271、I09AB-02487和I09AB-02493的細(xì)胞存活率基本為70% 以上，毒性較小，值得進(jìn)一步深入研究。

表1 陽性樣品的抑酶活性及抗菌活性Table1 Inhibitory effect of positive samples

表2 陽性樣品的細(xì)胞毒性Table2 Cytotoxicity of positive samples

3 討論

PDF 對原核生物蛋白質(zhì)的成熟起著關(guān)鍵作用，而在真核生物中并非必需。PDF蛋白的結(jié)構(gòu)很保守，在所有原核生物中同源性都較高。除此之外，PDF蛋白還容易在體內(nèi)外進(jìn)行活性分析。良好的毒性選擇性和序列的保守性，以及易純化并測活等特性都使得 PDF 成為較理想的廣譜抗生素藥物篩選的分子靶點(diǎn)之一，利用本研究建立的篩選模型還有望篩選得到對其他病原微生物具有抑制活性的化合物。

本研究的電泳結(jié)果顯示，表達(dá)得到的目的蛋白大部分存在于沉淀中。嘗試了不同的誘導(dǎo)條件，可溶性蛋白表達(dá)量均沒有得到明顯改善。這可能與蛋白本身是非大腸桿菌的外源蛋白有關(guān)，其他文獻(xiàn)也有此蛋白可溶性較小的報(bào)道[16-17]。但由于本研究蛋白用量較小，反應(yīng)體系中只需加入 20 ng PDF 酶，而純化 100ml 培養(yǎng)物即可得到 0.28 mg PDF 酶，足夠 10000余個(gè)樣品篩選之用，因此本研究中沒有嘗試去進(jìn)一步提高可溶蛋白量的表達(dá)。純化得到的蛋白分子量略大于理論值（20.939 kD），可能與表達(dá)的蛋白為含有 His的融合蛋白有關(guān)，His 增加了蛋白的分子量。另外，蛋白中脯氨酸殘基的存在也可能影響蛋白在SDS-PAGE 電泳中的正常遷移，從而使得與預(yù)期值不符。

本研究篩選得到的33個(gè)酶水平陽性樣品中，只有 8個(gè)具有抗恥垢分枝桿菌活性。推測可能的原因?yàn)椋孩倩钚晕镔|(zhì)穿透細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的能力較弱，無法有效進(jìn)入菌體內(nèi)與目的蛋白作用，生物利用度低；②盡管恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌具有較近的親緣關(guān)系，但兩者的PDF 酶氨基酸序列之間還是存在一定的差異性。因此，有必要在以后的工作中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)這 33個(gè)陽性樣品的抗結(jié)核分枝桿菌活性以及其對恥垢分枝桿菌 PDF 酶抑制活性。這 8個(gè)活性樣品中有 5個(gè)細(xì)胞毒性較小。細(xì)胞毒性較大的樣品也存在活性成分和毒性成分不同一的可能性，將通過后期的分離純化再次驗(yàn)證。

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