聯(lián)合檢測血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達對乳腺癌早期微轉移的診斷價值

張 瓊* 譚小軍 高蔚櫻

（廣州醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510095）

乳腺癌是一類嚴重危害婦女健康的主要惡性腫瘤。引起乳腺癌患者死亡最主要原因是遠處播散、轉移。瘤細胞進入外周血中的微轉移是腫瘤遠處轉移的必需步驟本研究利用熒光定量PCR技術，以人乳腺珠蛋白（hMAM）、細胞角蛋白19（CK19）、癌胚抗原（CEA）、乳腺上皮黏蛋白（SBEM）作為標志，檢測乳腺癌患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞，并初步探討其在微轉移檢測中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2011年12月我院治療的乳腺癌患者外周血標本100例。乳腺纖維腺瘤患者血標本70例及健康志愿者血標本l0例作為對照。所有患者均術前采血，術前均未經(jīng)化療、放療等任何治療。

表1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達聯(lián)合檢測結果

1.2 主要試劑、儀器

抽提總RNA的Trizol試劑購自Gibco BRL公司，SYBR Premix Ex Tag（Perfect Real Time）購自Takara公司，Lightcycler PCR熱循環(huán)儀購自Roche公司。hMAM上游引物5'-CCGACAGCAGCAGCCTC AC-3',下游引物5'-TCCGTAGTTGGTTTCTC AC-3'；CK19上游引物5'-CTGAGTGACATGCGAAGCCAATA-3',下游引物5'-ATCTTCCTGTC CCTCGAGCA-3'；CEA上游引物5'-TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAGGAAGAAGC-3',下游引物5'-GGGCCACTGTGGGCATCATGA TTGG-3'；SBEM上游引物5'-CTGCCCAGAATCCGACAACAG-3',下游引物5'-AGCAGTGGTCGCAGTGGTTGC-3'；β-actin上游引物5'-TTGCCGACAGGATGCAG AAGGA-3',下游引物5'-AGGTGGACAG CGAGGCCAGGAT-3'。以上引物均由Primer 5軟件設計，并由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取

取靜脈血5mL（棄去開始的1 mL，以防上皮細胞的污染），EDTA （1mg/mL）抗凝，生理鹽水稀釋2～3倍，用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，采用Trizol提取細胞總RNA用于檢測。

1.3.2 熒光定量PCR檢測

按照SYBR Premix Ex Tag試劑盒說明。反應體系20μL，包括cDNA模板2μL（陰性對照以蒸餾水代替），上下游引物各0.4μL，SYBR Premix Ex TaqTM染料10μL。在Lightcycler PCR熱循環(huán)儀上進行擴增和分析，擴增參數(shù)為： 50℃ 2min，95℃ 10min后;再94℃ 15 min，66℃ 1min，40次循環(huán)。

1.4 結果計算

表達量計算方法根據(jù)比較閾值法推導出目的基因的量= 2-△△Ct（cycle of threshold.Ct）。＞2判為陽性[1]。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達

乳腺癌組外周血hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA的陽性表達率分別為43%、36%、31%和46%；而乳腺纖維腺瘤患者CK19 mRNA的陽性表達率為8.10%，CEA mRNA的陽性表達率為2.86%，hMAM和SBEM未檢出；健康志愿者外周血中均未檢出。這4種標志物在乳腺癌患者外周血中的陽性表達率均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 外周血hMAM、CK19、CEA、SBEM mRNA表達聯(lián)合檢測對乳腺癌微轉移的診斷價值

單項檢測敏感度為31%一46%，4項聯(lián)合檢測對乳腺癌診斷的敏感度及準確性明顯升高（表1），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），特異性改變無統(tǒng)計學意義。

3 討 論

腫瘤細胞進入外周血中的微轉移是腫瘤遠處轉移的前提。以往研究多為探討單個微轉移標志物的作用，但乳腺癌的微轉移是一種多基因、多階段、多因素作用的結果，單一的一種診斷指標往往不夠。綜合應用多個指標通常可以彌補單一指標的敏感性或特異性不高的缺點，有效地提高其診斷準確率。

研究證實[2]hMAM mRNA的表達僅限于成人的乳腺組織和乳腺癌細胞株，在乳腺癌原發(fā)灶中的表達明顯高于正常乳腺組織，在正常淋巴結或外周血白細胞檢測不到hMAM mRNA的表達，可用于乳腺癌微轉移的檢測[3]。CK19表達于正常上皮及上皮源性原發(fā)腫瘤及其轉移腫瘤細胞，而血細胞無CKl9表達的細胞，可作為檢測循環(huán)癌細胞指標[4,5]。CEA過表達于消化道腫瘤、乳腺癌等腫瘤中，血清CEA水平與乳腺癌患者的導管受累情況、淋巴結轉移數(shù)和腫瘤分期有關[6,7]。SBEM是一種新的用于檢測乳腺癌微轉移的標志物[8]，僅在乳腺和唾液腺中表達，常常高表達于陽性淋巴結。

本研究資料顯示，乳腺癌患者外周血中hMAM、CK19、CEA和SBEM mRNA陽性表達率均明顯高于對照組，表明4種標志物對于檢測乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細胞具有較高的特異性。本研究中，單項指標對乳腺癌微轉移診斷的敏感度均較低，而4種標志物聯(lián)合檢測對乳腺癌微轉移診斷的敏感度及準確性明顯升高，同時又保持了較高的特異性，提示聯(lián)合檢測hMAM、CK19、CEA和SBEM可有效避免單一指標造成的遺漏，提高對乳腺癌微轉移的診斷正確率，因此可以作為一種檢測外周血循環(huán)腫瘤細胞的有效方法，有助于指導臨床合理用藥、判斷預后，是提高患者生存率的關鍵。

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