HPLC法測定蒙藥白葡萄中齊墩果酸的含量Δ

趙子龍，薛培鳳，王 麗，王 靜，趙 凱（內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059）

白葡萄為葡萄科植物歐洲葡萄Vitis vinifera L.的干燥成熟果實(shí)[1]，蒙藥名為查干-烏珠莫[2]，主要分布在新疆、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)。它具有清肺、止咳、平喘、滋養(yǎng)的功效，用于治療肺熱咳嗽、痰喘、麻疹、口渴等。白葡萄中含有葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖，酒石酸、草酸、枸櫞酸、蘋果酸、白藜蘆醇、齊墩果酸、原花青素等成分[3，4]，其法定標(biāo)準(zhǔn)載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)（蒙藥分冊）》，但該標(biāo)準(zhǔn)中僅有顯微鑒別項(xiàng)。因此，本試驗(yàn)建立了白葡萄中齊墩果酸的含量測定方法，為評價(jià)該蒙藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜（HPLC）儀，含紫外-可見檢測器、LC-20AT色譜工作站（日本島津公司）；AB135-S分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KH3200E超聲清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-200505）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。13批白葡萄藥材采（收）集自新疆各地，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鞠愛華教授鑒定均為葡萄科植物歐洲葡萄V.vinifera L.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[5]

色譜柱：依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸水溶液（85∶15）；檢測波長：220 nm，流速：1 mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含齊墩果酸0.3576 mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取切碎的本品（不超過5 mm）適量，置冰箱中冷凍后稱取20 g，與4 g硅藻土混合，用小型高速粉碎機(jī)粉碎，取粉末2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇45 mL，靜置30 min，超聲處理（功率：150 W，頻率：50 kHz）30 min，濾過，洗滌濾渣，合并濾液，蒸干，殘?jiān)眉状嫁D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取硅藻土0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)[6]

取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別注入HPLC儀測定，記錄色譜圖。結(jié)果，齊墩果酸峰的保留時(shí)間約為15.2 min，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5；在該色譜條件下，陰性對照溶液對樣品測定無干擾。色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對照品溶液（濃度：0.3576 mg·mL－1）5、8、10、12、15、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積積分值（Y）對進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝199914X－27830（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，齊墩果酸進(jìn)樣量在1.788～7.152 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定5次。結(jié)果，RSD＝1.51%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、3、5、7、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.98%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，樣品平均含量為0.08%，RSD＝1.21%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品適量，共6份，分別精密加入一定量齊墩果酸對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取不同產(chǎn)地白葡萄藥材共13批次，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述方法測定樣品中齊墩果酸的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

白葡萄含糖量高，不易粉碎，只能切成碎塊，但直接切碎后的碎塊極易重新黏附聚集，導(dǎo)致取樣不均、重復(fù)性差。經(jīng)摸索，樣品切碎成不超過5 mm小塊后，必須置冰箱中冷凍，然后再加入一定比例的輔料，并用小型高速粉碎機(jī)才可粉碎均勻，從而解決了上述問題。

試驗(yàn)先考察輔料種類和用量對藥材粉碎難易程度和藥材分散均勻程度的影響。經(jīng)過比較，藥材與淀粉、滑石粉、硅藻土分別以10∶7、2∶1、5∶1的比例混合，可使粉碎均勻。由于3種輔料對含量測定均無影響，在參考文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上，最終選擇硅藻土作為添加輔料。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為蒙藥白葡萄中齊墩果酸的含量測定方法。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（蒙藥卷）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004：369-370.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊[S].1998：12.

[3]馬 龍，劉 濤，向 陽，等.新疆葡萄中3種生物活性物質(zhì)的含量分析[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18（1）：28.

[4]王勁松.葡萄與葡萄酒中白藜蘆醇的含量及其影響因素[J].寧夏農(nóng)林科技，2003，6：81.

[5]廖麗紅，曾英彤，梁海勇.RP-HPLC法測定滋陰舒肝顆粒中齊墩果酸的含量[J].中國藥房，2008，19（24）：1896.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄36.

[7]王春勝，魏魁東，劉茂軍，等.冠脈丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中草藥，2007，38（10）：1518.