超聲波輔助提取橘皮中黃酮類化合物

黨婭，耿敬章，李新生

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001）

柑橘（Citrus reticulata Banco）為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物科屬[1]，我國(guó)是柑橘原產(chǎn)地之一，栽培柑橘已有4000多年歷史，目前我國(guó)柑橘的栽培面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第三[2]。柑橘果實(shí)富含礦物質(zhì)、VC、多種甙類等物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[3-4]，含有豐富的香精油、黃酮類、果膠、橙皮苷等生物活性物質(zhì)[5]。傳統(tǒng)的加工方法將大部分的柑橘皮不做任何處理便丟棄掉，不僅造成了極大的資源浪費(fèi)，也對(duì)環(huán)境造成了一定程度的污染。黃酮類化合物（Flavonoids）又名生物類黃酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物[6]，研究表明黃酮類化合物具有多種生物活性，可用于抗菌、消炎、抗突變、降壓等，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有顯著效果[7-8]。為了開(kāi)發(fā)利用橘皮資源，本文就橘皮黃酮類化合物的超聲輔助提取方法進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柑橘采于陜西城固，取皮，60℃烘干，粉碎，以備后用。

UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本Shimadzu公司；JBT/TCL400T/3PCD超聲波藥品處理機(jī)：濟(jì)寧金百特有限公司；中草藥粉碎面：天津市泰斯特儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華儀器有限公司；TDL-408系列離心機(jī)：上海安亨科技儀器廠；AL20型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.000 mg置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇2.0 mL使之溶解，再加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，每1 mL含無(wú)水蘆丁0.20 mg。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加氫氧化鈉溶液2.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。在最大吸收峰波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以含量為橫坐標(biāo)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=8.375x-0.0074，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998。

1.2.2 單因素對(duì)提取效果的影響

提取條件的研究主要考慮以下5個(gè)因素：濃度、溫度、時(shí)間、料液比、超聲頻率。

1.2.2.1 超聲頻率對(duì)提取效果的影響

稱取1.0000g粉碎的橘皮粉共4份，各加15mL60%乙醇，在室溫下分別用低頻（25.5kHz）、中頻（47.6kHz）、高頻（69.3 kHz）超聲輔助提取20 min，并以水浴提取作為對(duì)照，提取液離心（4000 r/min）20 min，紫外測(cè)定吸光度值。

1.2.2.2 乙醇的濃度對(duì)提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共5份，分別加入濃度為20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL，在低頻超聲下提取 20 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測(cè)定吸光度值。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，各加15 mL 60%乙醇，分別在低頻超聲條件下提取10、20、30、40、50、60 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測(cè)定吸光度值。

1.2.2.4 提取溫度對(duì)提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共8份，各加15 mL 60%乙醇，分別在低頻超聲條件下 15、25、35、45、55、65、75、85℃條件下提取20 min（乙醇的沸點(diǎn)是78℃），離心（4000 r/min）20 min，紫外測(cè)定吸光度值。

1.2.2.5 料液比對(duì)提取效果的影響

稱取1.0000 g粉碎的橘皮粉共6份，使用60%乙醇為溶劑，分別在低頻超聲條件下，以 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL 的料液比提取 20 min，離心（4000 r/min）20 min，紫外測(cè)定吸光度值。

1.2.3 正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝

鑒于提取溶劑濃度、溫度、時(shí)間、料液比、超聲波頻率對(duì)橘皮中黃酮的提取均有一定的影響，通過(guò)L16（45）正交試驗(yàn)確定最佳提取條件，試驗(yàn)水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)提取效果的影響

2.1.1 超聲頻率對(duì)提取效果的影響

不同超聲頻率下提取的黃酮液經(jīng)離心后檢測(cè)510nm處吸光度值，結(jié)果如圖1所示。

表1 正交試驗(yàn)水平表Table1 The levels of orthogonal test

圖1 超聲頻率對(duì)橘皮黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic frequency on extraction（510 nm）

由圖1可知，超聲頻率在0～25.5 kHz時(shí)，黃酮提取率隨超聲功率逐漸增大而增高。當(dāng)功率達(dá)到25.5 kHz時(shí)提取率是最高，達(dá)到0.507，此后增大頻率黃酮的提取率反而緩慢下降，這可能是由于頻率過(guò)大時(shí)的超聲波產(chǎn)生的熱量過(guò)多，且會(huì)降低質(zhì)點(diǎn)之間的能量傳遞。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

不同濃度的乙醇提取的黃酮液均經(jīng)離心檢測(cè)510nm處吸光度值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響（510 nm）Fig.2 Effect of concentration on extraction（510 nm）

由圖2可知，乙醇濃度在40%以下時(shí)，提取率比較低，而且變化緩慢，濃度在40%～60%之間時(shí)，提取率明顯提高；濃度超過(guò)60%提取率反而會(huì)下降，濃度在80%以后提取率基本處于平緩狀態(tài)。這是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度增加時(shí)，某些溶質(zhì)溶出也增多，因而會(huì)降低黃酮的提取率，而且還會(huì)給提純帶來(lái)困難。因此，用乙醇作溶劑時(shí)，濃度應(yīng)以60%最為適合。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

提取不同時(shí)間的黃酮液均離心后檢測(cè)510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)橘皮黃酮提取效果的影響（510 nm）Fig.3 Effect of time on extraction（510 nm）

由圖3可知，10 min～20 min內(nèi)橘皮黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的增加而急劇增加，隨之黃酮的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加緩慢。這是因?yàn)?，剛開(kāi)始黃酮溶出率比較低，溶液中的黃酮含量少，因此隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可以提高黃酮的提取速率。隨著橘皮中大部分的黃酮已被提取出，此時(shí)再延長(zhǎng)時(shí)間則溶出速率緩慢，且逐漸達(dá)到平衡。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取效果的影響

不同溫度下提取的黃酮液均離心后檢測(cè)510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對(duì)提取效果的影響（510 nm）Fig.4 Effect of temperature on extraction（510 nm）

由圖4可知，溫度在15℃到25℃時(shí)，提取率與提取溫度成正比，而85℃時(shí)有所回落，其原因可能是較高的溫度一方面會(huì)使提取出的黃酮分解，一方面導(dǎo)致乙醇溶劑的揮發(fā)，從而降低了提取效果。

2.1.5 料液比對(duì)提取效果的影響

不同料液比提取的黃酮液均稀離心后檢測(cè)510 nm處吸光度值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)提取效果的影響（510 nm）Fig.5 Effect of material ratio and solvent on extraction（510 nm）

由圖5可知，黃酮提取液的吸光度值隨料液比的增大而降低，其原因可能是：在橘皮粉與提取溶劑可以充分混溶的條件下，過(guò)量的溶劑的稀釋效果大于它對(duì)黃酮的提取效果。

2.2 最佳提取工藝的確定

按表1所示的試驗(yàn)水平進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

由表2可知，影響橘皮黃酮提取效果的因素的主次順序?yàn)镋>D>C>B>A，即料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間>超聲頻率，其最優(yōu)組合為A2B4C4D2E1，做驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得由該組條件所得的黃酮液的吸光度值為0.914，符合上述結(jié)論。因此可確定超聲波輔助提取橘皮黃酮的最佳提取工藝條件：超聲波頻率為低頻（25.5 kHz），提取溶劑為60%乙醇，提取時(shí)間為40 min，提取溫度為 75 ℃，料液比為 1∶10（g/mL）。

3 結(jié)論

超聲輔助法從橘皮中提取黃酮類成分的工藝成本低，提取效果好，因此有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)結(jié)果表明，僅從單因素考慮：低頻超聲波（25.5 kHz）的提取效果較好，60%乙醇的提取效果較好，提取效果與提取時(shí)間成正比，75℃的提取效果較好，通過(guò)L16（45）正交試驗(yàn)綜合分析，得出該橘皮黃酮的最佳提取工藝：超聲波頻率為低頻（25.5 kHz），提取溶劑為60%乙醇，提取時(shí)間40min，提取溫度75℃，料液比1∶10（g/mL）。

[1]賈長(zhǎng)英,唐麗華,李衛(wèi)華,等.桔皮黃色素提取工藝研究[J].化工技術(shù)與開(kāi)發(fā),2004,33(1):41-44

[2]鐘巖,李澤鴻,周丹.桔皮黃色素提取方法的研究[J].北方園藝，2008(3):30-31

[3]Kang H J,Chawla S P,C Jo.Studies on the development of functional powder from citrus peel[J].Bioresource technology,2006,97:614-620

[4]李佑稷,宋智娟.橘皮黃色素提取工藝研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,28(11):28-32

[5]夏湘,趙良忠,袁其麗,等.雪峰蜜橘果皮色素的穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2008,29(12):102-106

[6]鐘地長(zhǎng),張淑鳳,陳振鋒,等.天然產(chǎn)物黃酮類化合物的提取、純化及其金屬配合物的研究進(jìn)展[J].化學(xué)世界,2006,47(9):561-564

[7]侯冬巖,回瑞華,劉曉媛,等.洋蔥皮中黃酮化合物的超聲提取與光譜分析[J].食品科學(xué),2006,23(3):172-174

[8]于麗娜,張永忠,辛禹,等.超聲波法提取紅三葉草總異黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2006(9):128-129