兩種大腸桿菌顯色培養基檢測效果的比較

張淑紅，鄭揚云，吳清平，徐曉可，張菊梅，郭偉鵬

（廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和動物腸道的正常菌群，當機體抵抗力下降或其侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌引起腸道外感染，是國際上公認的衛生監測指示菌，食物或水中大腸桿菌的檢出即意味著直接或間接的近期糞便污染。

在國內外各種標準檢驗方法中，食品中大腸桿菌的分離通常采用麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂（EMB），并結合其他生化反應如乳糖發酵情況、氧化酶試驗、三糖鐵瓊脂（TSI）、靛基質試驗、尿素酶試驗、糖發酵等進行鑒定，檢測周期較長。

近年來，一些顯色培養基被逐步研發出來，用于大腸桿菌的快速分離和鑒定。與傳統分離培養基相比，顯色培養基省去了對菌株進行純培養的步驟，直接根據菌落顏色就可以做出初步判斷，具有更高的敏感性和特異性，操作簡便快速，可大大節省人力和物力[1-3]。

廣東環凱HKM和法國科瑪嘉CHROMagar E是國內外檢測機構和食品企業應用較多的兩種大腸桿菌顯色培養基，為進一步探討顯色培養基的應用價值，本研究隨機采集了廣州市區超市和集貿市場的100份食品樣品，通過分析食品中大腸桿菌的污染情況，比較了HKM和CHROMagar E顯色培養基的應用效果，為顯色培養基的開發和技術改進提供基礎研究資料參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源

100份食品分別采自廣州市區的超市和農貿市場，包括肉制品19份（包括生鮮和冷凍豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉、臘肉等）、速凍食品12份（餃子、云吞）、乳制品14份（巴氏殺菌乳、高溫殺菌乳、豆奶等）水產品16份（魚、蝦、貝類）、果蔬16份、熟食19份（涼拌菜、粉面和熟肉制品等）、食用菌4份。

1.1.2 主要儀器設備

移液器100-1000 μL：北京吉爾森科技有限公司；生物安全柜AC2-4S1：廣州浩瀚儀器有限公司；全自動高壓滅菌鍋TOMYES-215：日本三洋公司；一次性接種環1 μL：恒溫培養箱DNP-9082、恒溫水浴鍋DK80：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養基和試劑

CHROMagar E大腸桿菌顯色平板：由鄭州博賽生物技術研究所分裝；乳糖膽鹽發酵培養基、HKM大腸桿菌顯色培養基：廣東環凱微生物科技有限公司生產；API 20E生化鑒定試劑條：法國生物梅里埃公司生產。以上培養基和試劑均在有效期內使用。

1.2 檢驗方法

檢測方法參考GB/T4789.6-2003《食品衛生微生物學檢驗-致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[4]，具體方法如下。

1.2.1 樣品處理

無菌條件下將樣品在徹底剪碎，混勻，以無菌操作取樣品25 g（mL）加入到含有225 mL滅菌生理鹽水的均質袋中，在拍擊式均質器上連續均質1min～2 min。

1.2.2 分離

參考大腸菌群MPN計數的檢驗程序對大腸桿菌進行MPN計數[5]，按9管法將樣品處理液接種乳糖膽鹽發酵管，（36±1）℃培養24 h后，取產酸產氣的乳糖發酵管中的菌液劃線接種于HKM和CHROMagar E顯色培養基，于（36±1）℃培養 18 h～24 h，觀察各個平板上生長的菌落。每個平板上挑取2個～3個疑似菌落，劃線接種NA平板純化，（37±1）℃培養18 h，進行鑒定。

1.2.3 鑒定

挑取純培養可疑菌落，進行染色鏡檢和氧化酶試驗，同時利用API 20E鑒定條進行生化鑒定。

1.2.4 統計方法

運用SPASS13.0軟件對數據進行統計分析，采用卡方檢驗比較兩種大腸桿菌培養基陽性率的差異。

2 結果與分析

2.1 兩種培養基大腸桿菌生長狀況

將樣品增菌液劃線接種顯色培養基18 h～24 h后，可以直接觀察到藍綠色菌落生長，如圖1所示。

圖1 兩種顯色平板上大腸桿菌生長情況Fig.1 The performance of E.coli on two chromogenic media

在HKM大腸桿菌顯色平板上，可疑大腸桿菌為圓形、光滑、邊緣整齊、直徑1 mm～2 mm的深藍色或藍色，在CHROM agar E大腸桿菌顯色平板上，可疑大腸桿菌呈現圓形、光滑、邊緣整齊、直徑1 mm～2 mm的藍色或綠色菌落，色澤均較HKM顯色平板稍淺。檢驗過程中發現，在雜菌抑制方面，CHROMagar E顯色培養基略好于HKM顯色培養基。

2.2 兩種培養基大腸桿菌檢出率比較

兩種培養基大腸桿菌檢出率結果見表1。

表1 兩種顯色培養基上大腸桿菌的檢出情況Table 1 The positive rate of E.coli on the two chromogenic media

本次試驗共檢測蔬菜水果16份，HKM顯色培養基檢出大腸桿菌7份，陽性率43.8%，CHROMagar E顯色培養基檢出大腸桿菌6份，陽性率為37.5%，卡方檢驗表明，兩者無顯著性差異（X2=0.13，P=0.719>0.05）；檢測肉制品19份，HKM顯色培養基檢出大腸桿菌17份，CHROMagar E顯色培養基檢出大腸桿菌17份，兩者陽性率吻合，無差異；其余樣品包括速凍食品、乳制品、水產品、熟食、食用菌等，兩種培養基檢出率吻合，檢驗結果均無差異；統計100份樣品中，兩種顯色培養基大腸桿菌的檢出率分別為66%和65%，卡方檢驗結果顯示二者沒有顯著差異（X2=0.22，P=0.882>0.05）。

2.3 兩種培養基配對試驗結果比較

對兩種培養基上分離的疑似菌落進行純化和API 20E鑒定，結果從兩種平板上分離到3種假陽性菌株，其中HKM平板分離到4株，CHROMagar E平板上分離到5株，菌株分離鑒定結果如表2。表明兩種顯色平板都存在一定的假陽性。

表2 兩種顯色平板上假陽性菌株的分離鑒定情況Table 2 False positive strains from the two chromogenic media

3 討論

顯色培養基最大的優點是在分離培養的同時包括顯色鑒定，這一過程只需18 h～24 h，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。這種基于酶的試驗方法具有簡便、快速、準確、特異性好等優點，近年來，在臨床診斷及食品微生物檢驗中顯示了獨特的優勢[6-13]。目前，許多顯色培養基已得到美國食品和藥物管理局（FDA）、國際官方分析化學家協會（AOAC）等官方的認可，并逐步被引入到國內外各種標準檢驗方法中，用于食源性致病菌的快速檢測。我國最新執行的食品安全國家標準GB4789-2010食品微生物學檢驗中，已引入顯色培養基作為分離培養基，將顯色培養基與前增菌和選擇性增菌等步驟相結合，可以顯著提高目標菌的檢出率。

市場上現有的顯色培養基產品中，法國科瑪嘉的系列顯色培養基是國內外普遍認可和廣泛應用的產品，質量穩定，但價格相對較高。國內廣東環凱微生物科技有限公司近年來也推出了一系列的顯色培養基產品。本試驗中，我們隨機采集了廣州市區各類食品樣品進行檢驗，比較了兩種大腸桿菌顯色培養基的應用效果。總體而言，兩種培養基的檢測效果基本相當，將增菌液劃線接種顯色培養基18 h～24 h后，根據藍綠色菌落的有無就可初步判斷結果。大腸桿菌在兩種培養基上都呈現藍色-綠色菌落，在HKM平板上，目標菌的顏色稍濃于CHROMagar E顯色培養基，分析可能是培養基中加入了更高濃度的顯色底物，使菌落顯色更深；而在非目標菌的抑制方面，CHROMagar E培養基的抑菌效果更好一些，雜菌生長相對較少。從陽性樣品的檢出情況來看，此次抽檢的100份食品樣品中，99份樣品的檢測結果吻合，1份樣品檢測結果有差異（生菜、樣品號54#），兩種培養基的檢出率經卡方檢驗沒有顯著性差異。54#樣品CHROMagar E檢測結果陰性而HKM檢測陽性，將HKM平板上分離的菌株采用API 20E條進行鑒定，結果證實為大腸桿菌（API數值編號：5444573，93.2%，good identification），即 CHRO Magar E培養基出現1份假陰性結果。CHROMagar E出現漏檢可能與培養基中加入的抑菌劑成分或者高濃度有關，通常情況下，為了提高樣品中目標菌的檢出率，顯色培養基中會加入特定種類和濃度的抑菌劑，抑制其他雜菌的生長，盡管抑菌劑可以起到抑制雜菌的目的，但是某些情況下也會對目標菌生長造成一定影響，特別是當樣品成分復雜、目標菌活力較低、處于非可培養狀態時，高濃度的抑菌劑可能影響目標菌的復蘇和檢出。

此外，在兩種平板上，除了檢出目標菌外，都有假陽性菌株分離到。由于實際樣品中細菌種類繁多，不排除某些細菌會有與目標菌同樣的酶，即某些非大腸桿菌的細菌也會存在大腸桿菌所具有的β-D-葡萄糖苷酶，在顯色培養基上呈現與目標菌同樣的顏色，因此可能會有假陽性結果出現。對于假陽性的結果，需要檢驗人員根據經驗來判斷。

顯色平板畢竟是基于生化特點設計的培養基，不可避免會出現假陽性和假陰性的結果。事實上，顯色培養基自推出和使用以來，其技術和配方也在不斷改良和優化中。收集大量實際樣品和實驗菌株進行驗證是其中最常用的手段，一方面通過優化基礎配方和顯色劑種類及濃度，使得目標菌利于復蘇和生長，顯色清晰可辨；一方面，選擇更為高效的抑菌劑最大程度地減少非目標菌的生長，逐步提高顯色培養基的特異性，最終目的使得檢測結果更準確，更能接近和真實反映樣品中致病菌的污染情況。

由于本實驗所涉及的樣品種類和數量有限，實際樣品中可能還會出現各種各樣不可預知的情況，所以要評價大腸桿菌顯色培養基的應用效果，還需要大量樣本加以驗證。另外，對于假陽性和假陰性結果，在實際應用中，可盡量挑取較多的疑似菌株進行鑒定，同時可平行使用多個平板，減少檢測果誤差，提高檢測結果的準確性。

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