脊髓損傷后大鼠甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的表達及甲基強的松龍干預后的變化*

羅奮棋 徐杰

脊髓損傷后，神經細胞增生肥大，胞漿呈嗜酸性，突起變粗，分支增多。這些改變可起到減輕損傷及填補組織損傷而形成的空洞等作用，為神經再生創造條件；但聚集的星形膠質細胞所形成的膠質性瘢痕及其所分泌和表達的抑制性因子形成機械及化學屏障對上下行神經元軸突的再生有明顯的阻礙作用[1]。N2末端為甘氨酰2脯氨酰的肽鍵能被GDPA特異地水解，而該肽鍵正是構成膠質的基本結構[2]，因此，推測GPDA在緩解星形膠質細胞所構成的機械和化學屏障中起到作用，從而改善脊髓繼發性損傷的進一步發展。本文對GDPA基因在多種情況下表達的變化進行研究，并探討脊髓損傷早期，GDPA對繼發性脊髓損傷的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 Sprague-Dawley大鼠（中科院上海實驗動物中心提供，10周齡）36只，體重180～240g。根據隨機表分為三組。假手術組、脊髓損傷未使用藥物干預組（創傷組）、脊髓損傷+甲強龍干預組 （甲強龍組）。每組12只。在大鼠脊髓損傷后24 h將損傷的脊髓組織切取，進行逆轉錄PCR反應。檢測GDPA的表達。

1.2 手術方法 腹部消毒后腹腔內注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腰背部備皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打擊法（5 g×5 cm）制作脊髓損傷模型，甲強龍組大鼠靜脈注射甲基強的松龍（30 mg/kg），假手術組未做任何處理關閉切口，創傷組大鼠靜脈內注射等量的0.9%氯化鈉溶液。24 h后切除脊髓損傷部位上下1 cm的脊髓組織切取，進行RT-PCR反應。

1.3 逆轉錄PCR反應

1.3.1 脊髓神經細胞總的RNA使用Trizol液提取 1 ml Trizol液中加入1 g組織，反復吹打數次。混合均勻后加入0.2 ml氯仿，并予以離心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml異丙醇，離心（12 500 r/min，10 min）。沉淀物加入30 μl DEPC溶化。

1.3.2 RNA定量和鑒定 紫外分光光度計定量RNA，計算OD260、OD280及比值。取總RNA3 μg，電泳（瓊脂糖凝膠）30 min，使用紫外光顯示28 s及18 s兩條rRNA帶，說明RNA提取完整性好。

1.3.3 以Vector NTI Suite軟件設計檢測引物 引物序列：正義：5’TTGCGTGCTGCTATAGTGG 3’，反義：5’ ACTGCGCCACGAATTTGGG 3’，擴增產物長度：254bp。β-Actin檢測引物序列如下：正義：5’ GGGCAATGG TCAGTAGGAT 3’（176-196），反義：5’ CAGTGTGTGACGAG TCCGT 3’（277-257）。擴增長度為 264 bp。

1.3.4 用One-tube RT-PCR system（Roche公司）進行一步法反轉錄和擴增。

1.4 取5 μl PCR擴增產物電泳，掃描DNA密度，分析基因表達的相對豐度。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件在計算機上進行分析。計量資料以（±s）表示，兩組間采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

圖3 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR結果

2 結果

假手術組GDPA的mRNA的表達的相對豐度為1.5403±0.1604；脊髓損傷24 h后創傷組GDPA的表達的相對豐度為0.5994±0.3414，與假手術組相比差異有非常顯著統計學意義（P<0.01）；GDPA在脊髓損傷后使用甲強龍干預組中的表達相對豐度為1.8432±0.1294，與創傷組比較差異有非常顯著統計學意義（P<0.01）。表明大劑量甲基強的松龍的早期使用能促進脊髓損傷后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達恢復，發揮細胞保護作用。（表1，圖1）。β-Actin的RT-PCR結果見圖2，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR結果見圖3。

表1 脊髓損傷后24 h二肽氨基肽酶表達情況（±s）

表1 脊髓損傷后24 h二肽氨基肽酶表達情況（±s）

圖1 GPDA表達的相對豐度

圖2 β-Actin的RT-PCR結果

3 討論

外傷后脊髓的功能完全恢復的可能性是比較小的，在受到外傷后很短時間內就會發生繼發性的損傷，所以給予早期保護治療非常的重要。甲基強地松龍為激素類藥物，其可對此疾病進行治療，現今多應用于急性脊髓損傷的早期治療。

早在1966年，Hopsu-Havu等[3]發現甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶。而后多位專家經過分析證明了該酶的活性[4]。為了探索其他哺乳動物組織中是否含有此酶， 他們首先以鼠肝為樣品進行了研究，同樣證實在鼠肝和鼠腎中都存在這種新的二肽氨基肽酶，即現在所稱的GPDA[5-6]。

文中建立的模型應用打擊法，造成模型脊髓損傷，此模型和人體受到外傷的情況比較相似，相關性比較好。本研究發現脊髓組織有甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達，脊髓損傷24 h后，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達顯著降低，大劑量甲基強的松龍能促進甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達，到達治療效果。

[1]Park S J，Oh I S，Kwon J Y，et al.The effect of irradiation and methylprednisolone in spinal cord injured rats[J].Spine，2011，36（6）:434-440.

[2]Hall E D.Antioxidant therapies for acute spinal cord injury[J].Neurotherapeutics，2011，8（2）:152-167.

[3]Hopsu-Havu V K，Glenner G G.A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide[J].Histochemie，1966，7（3）:197-201.

[4]Liu H D，Ni R Z，Xiao M B，et al.Clinical significance of serum GPDA-F determined by immunoelectrophoresis in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Immunology，2006，5（2）:247-249.

[5]Thompson Coon J，Rogers G，Hewson P，et al.Surveillance of cirrhosis for hepatocellular carcinoma:systematic review and economic analysis[J].Health Technol Assess，2007，11（34）:201-206.

[6]Stammers A T，Liu J，Kwon B K.Expression of inflammatory cytokines following acute spinal cord injury in a rodent model[J].J Neurosci Res，2012，90（4）:782-790.