β伴大豆球蛋白糖基化改性對其乳化性影響的研究

張 波，遲玉杰，2，*

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030;2.大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

大豆蛋白是一種重要的植物蛋白資源，具有較高的營養價值和獨特的功能性質，乳化性是其在食品工業生產上重要的功能性質［1］。大豆中近90%的蛋白質是以貯藏蛋白的形式存在，其中主要是大豆球蛋白(11S)和β－伴大豆球蛋白(7S)。大豆蛋白的乳化性與這兩種成分密切相關［2－3］。Rivas曾報道7S球蛋白的乳化性能要明顯高于11S球蛋白［4］。目前，工業上生產的大豆分離蛋白(SPI)是11S和7S球蛋白的混合物，11S和7S各自的功能特性得不到充分體現，制約了大豆分離蛋白在食品加工中的應用。近年來，蛋白質與多糖的糖基化改性受到廣泛地關注，經改性的蛋白質功能性(如水溶性、乳化性、疏水性及脂肪吸收力等)有很大地改善［5］。蛋白質的糖基化反應主要有干熱法和濕熱法［6］。濕熱法較干熱法相比，條件相對簡單，反應速率快，主要用于蛋白質與單糖或雙糖的接枝反應，而與多糖進行反應的報道相對較少，有研究表明，多糖的加入較單糖與雙糖更能提高蛋白質的功能性質［7］。黃原膠(XG)具有獨特的物理性質(高粘度，假塑性)和化學性質(高溶解性，pH穩定性)而被廣泛地應用在食品工業生產中［8］。本文選用黃原膠對β－伴大豆球蛋白進行濕法糖基化改性，優化制備具有良好乳化性能的7S球蛋白改性條件，為高乳化性大豆蛋白的實際生產提供一定的理論依據，同時豐富功能專用型大豆蛋白的種類，并拓寬大豆蛋白在食品工業中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

低溫脫脂豆粕(蛋白質:53.61%、脂肪:0.92%、灰分:5.80%、水分:9.1%) 黑龍江省哈高科大豆食品有限責任公司，經粉碎，過60目篩得脫脂豆粉;大豆油 九三集團哈爾濱惠康食品有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)Sigma公司;葡萄糖、乳糖、黃原膠 天津市天理化學試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)化學純;其他試劑均為分析純。

LD4－2A型離心機 北京醫用離心機廠;FDU－1200型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;KND－HYP8型消化爐、KDN－2008全自動定氮儀上海纖檢儀器有限公司;FS－1可調高速勻漿機 金壇市榮華儀器制造有限公司;TU－1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;熒光分光光度計(LS55) 美國Perkin－Elmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆7S球蛋白的制備 大豆7S球蛋白根據國際上普遍使用的 Thanh 等人［9］和 Nagano 等人［10］的經典方法為基礎進行優化制備［11－12］。凱氏定氮法測定β－伴大豆球蛋白的蛋白質含量為92.30%(N×6.25)。

1.2.2 分析方法 蛋白質含量按GB 5009.5－2010，使用凱氏定氮法測定，蛋白質轉換算系數以6.25計。水分按GB 5009.3－2010測定。灰分按GB 5009.4－2010測定。

1.2.3 SDS－PAGE電泳 用SDS－PAGE非連續凝膠電泳對1.2.1中提取的大豆7S球蛋白組分進行分析，濃縮膠和分離膠的質量分數分別為4.0%和12%，考馬斯亮藍R－250染色。用BandScan5.0軟件對電泳凝膠圖像進行分析。

1.2.4 乳化活性及乳化穩定性的測定 本實驗采用濁度法測定［13］，略作改進:用 pH7.0，0.1mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液配制100mL 0.5%(m/v)的蛋白懸浮液，取30mL蛋白液于高速勻漿機中，加入10mL大豆油，10000r/min均質1min以形成乳濁液，均質后，分別在0min與10min時從底部吸取100μL分散于10mL 0.1%SDS(m/v)中，于500nm處測定吸光度值(測定三次取平均值)，以A0表示乳化活性(EAI)，乳化穩定性(ESI)的表示方法為:

式中:A0:0min時的吸光度值;t:測定乳化性的兩次時間間隔，本實驗取10min;A10:10min時的吸光度值。

1.2.5 糖基化蛋白的制備 根據N Diftis等人［14］的實驗方法，稱取一定量的β－伴大豆球蛋白，溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，按一定比例添加糖，充分攪拌溶解。將燒杯用保鮮膜封口，放置到一定溫度的水浴中恒溫反應，每間隔30min取樣，裝到離心管中，冰浴冷卻后1500g離心15min除去不溶物，上清液4℃透析24h，凍干得到糖基化產物。

1.2.6 糖基化程度測定 采用OPA法對蛋白中糖基化程度(DG)進行測定［15］。

1.2.7 表面疏水性的測定(H0) 表面疏水性是用1－苯氨基萘－8－磺酸(ANS)作為熒光探針進行測定［16］。

1.2.8 溶解度的測定 蛋白質溶解性采用氮溶解指數(NSI，%)表示，采用 Lowry 法［17］測定。

1.2.9 褐變程度的測定 取反應后樣品液2mL，加入2mL稀釋液(含質量分數10%SDS，0.05mol/L硼砂)，以蒸餾水(稀釋液)做空白，測420nm處的吸光值，褐變程度以吸光值大小表示［18］。

1.2.10 實驗設計 根據單因素實驗結果與實際生產要求選取合適的因素水平，并根據螺旋中心組合設計原理，采用軟件 Design Expert 7.1中 Box－Behnken模型對反應條件進行優化。各因素水平編碼表如表1所示。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Experiment design for levels of factors

2 結果與分析

2.1 大豆7S球蛋白SDS－PAGE電泳分析

由圖1可以明顯看出，電泳圖中大豆7S球蛋白三個亞基(α'，α，β)分離較明顯，且泳帶上幾乎不存在大豆11S球蛋白的兩個亞基染色帶(AS，BS)，表明所提取的大豆7S球蛋白組分純度較高。通過BandScan5.0軟件對圖像進行分析，得出7S組分純度達89%以上。

圖1 大豆11S蛋白和大豆7S球蛋白樣品電泳圖Fig.1 Electrophoresis picture of β－conglycinin and glycinin

2.2 濕法糖基化反應的單因素研究

本實驗選擇以黃原膠為糖基供體，分別對反應溫度、反應時間、多糖添加量進行單因素實驗，根據糖基化β－伴大豆球蛋白的乳化活性高低初步確定反應條件。

2.2.1 反應溫度對乳化活性的影響 如圖2所示，糖基化β－伴大豆球蛋白乳化活性隨反應溫度升高呈現先增加后降低的趨勢，反應溫度對糖基化產物具有顯著影響(p＜0.01)。糖基化改性的目的是在蛋白分子結構改變較小的情況下，盡量增加蛋白質中親水性基團的數量，從而使蛋白質達到更好的親水親油性的平衡。在一定范圍內隨反應溫度升高，β－伴大豆球蛋白與糖共價交聯速度加快，蛋白質結構展開，提高大分子表面活性，增加復合物親水性，從而提高其乳化活性;但當反應溫度繼續升高超過一定程度時，蛋白質變性嚴重，共價復合物界面活性降低，導致糖基化β－伴大豆球蛋白乳化活性降低。

圖2 不同反應溫度對乳化活性的影響Fig.2 Effect of different reaction temperature on emulsifying activity index

2.2.2 反應時間對乳化活性的影響 結合圖3可以看出，隨著反應時間的增加，復合物的乳化活性呈現先上升后下降的趨勢。當反應時間為2h時，乳化活性最高。這可能由于反應開始糖鏈的引入，羥基的親水特性使得蛋白質的溶解性顯著提高，糖基化改性的蛋白質部分可有效地吸附在油—水界面上，降低界面的張力，共價結合的糖分子(特別是多糖分子)鏈在吸附膜的周圍形成立體網絡狀結構增加了膜的厚度和機械強度，從而增加了接枝物的乳化活性。隨著反應到一定程度以后，其交聯程度越來越高，使復合物過于親水而失去界面活性，從而產物的乳化活性開始降低。

圖3 不同反應時間對乳化活性的影響Fig.3 Effect of different reaction time on emulsifying activity index

2.2.3 糖添加量對乳化活性的影響 蛋白和多糖的分子間共價結合是在一定的基團間進行的，適當的反應物配比不僅可以提高反應的速度和最終的反應程度，而且還可以減少副反應(如焦糖化)的發生。由圖4可以發現，糖添加量對糖基化蛋白乳化活性具有顯著影響(p＜0.01)，隨著糖的添加量增加而呈現出先上升后下降的趨勢。糖的添加量為7%時，蛋白的乳化活性最大。

2.3 響應面實驗優化結果

2.3.1 響應面實驗設計方案及實驗結果 根據實驗因素水平編碼表，響應面實驗設計方案及結果見表2:

以乳化活性和乳化穩定性為響應值，運用Design expert 7.1軟件對實驗數據進行回歸擬合分析，建立各因子對響應值的回歸方程:

圖4 不同黃原膠添加量對乳化活性的影響Fig.4 Effect of adding contents of different xanthan gum on emulsifying activity index

表2 實驗設計條件及結果Table 2 Design and results of experiment

由表3的方差分析可以看出，乳化性和乳化穩定性回歸方程模型F檢驗顯著(p＜0.05)，EAI/ESI失擬項不顯著(0.4860＞0.0500;0.2062＞0.0500)，說明回歸方程的擬合程度較好，實驗誤差較小，同時，模型的決定系數(0.9977)均大于0.8000，因此，該模型可用于預測不同條件下糖基化復合物的乳化性，也可用于優化濕法糖基化反應條件。

2.3.2 響應面的優化 根據復合物乳化活性和乳化穩定性模型的二次回歸方程，利用Design Expert 7.1軟件對濕法糖基化反應工藝條件進行優化，如圖5～圖6。以乳化活性為響應值，反應溫度為89.19℃，反應時間為2.08h，糖添加量為6.82%，乳化活性可以達到1.062;而以乳化穩定性為響應值，反應溫度為90℃，反應時間為2.13h，糖添加量為7.54%，乳化穩定性可以達到27.22min。考慮到具體實驗的可操作性，以減少能量損耗和反應時間為基準，選擇反應溫度為90℃，反應時間為2h，糖添加量為7%條件下進行了5次驗證實驗(數據未顯示)，乳化活性平均為1.132，乳化穩定性平均為27.16min，驗證實驗結果與理論預測值接近，表明Box－Behnken模型優化可用

于糖基化反應條件優化，所得參數準確可靠，具有實用價值。由表4可以看出，經優化后的糖基化β－伴大豆球蛋白的乳化活性和乳化穩定性分別是未經處理7S的2.15倍和2.26倍，增加了蛋白質的表面疏水性和溶解性，且褐變程度不明顯;對比發現單獨的添加黃原膠(不加熱)沒有明顯改善大豆7S球蛋白的表面疏水性、溶解性及乳化性;此外發現7S球蛋白經90℃加熱2h后乳化性明顯降低。這可能是由于蛋白質加熱破壞了蛋白質的分子結構，促使蛋白質內部的疏水基團暴露，表面疏水性提高，溶解性降低造成的。

表3 乳化活性/乳化穩定性回歸方程的方差分析表Table 3 Variance and significant analysis for regression equation of EAI/ESI

表4 空白與糖基化改性β－伴大豆球蛋白性能的比較(pH7.0)Table 4 Comparison of the properties between native and glycosylation modification 7S at pH7.0

圖5 乳化活性影響因素的響應面分析Fig.5 Response surface analysis of factors influencing EAI

圖6 乳化穩定性影響因素的響應面分析Fig.6 Response surface analysis of factors influencing ESI

3 結論

3.1 單因素實驗結果表明，反應溫度、反應時間、黃原膠添加量均對制備復合物乳化活性和乳化穩定性影響顯著(p＜0.01)。

3.2 利用Box－Behnken模型對濕法糖基化β－伴大豆球蛋白的制備技術進行了優化，方差分析表明擬合較好。結果表明多糖黃原膠與β－伴大豆球蛋白濕法糖基化反應能夠顯著改善復合物的乳化性。優化條件為:反應溫度90℃，反應時間2h，糖添加量7%，乳化活性(EAI)為1.132，乳化穩定性(ESI)為27.16，分別是未改性7S球蛋白的2.15倍和2.26倍。

［1］MCPuppo，V Beaumal，N Chapleau，et al.Physicochemical and rheological properties of soybean protein emulsions processed with a combined temperature/high－ pressure treatment［J］.Food Hydrocolloids，2008(22):1079－1089.

［2］Mujoo R，Trinh D T，Ng P K W.Characterization of storage proteins in different soybean varieties and their relationship to tofu yield and texture［J］.Food Chemistry，2003，82:265－273.

［3］Prak K，Nakatani K，Katsube－ Tanaka T，et al.Structurefunction relationships of soybean Proglycinins at subunit levels［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53:3650－3657.

［4］U Shigeru，M Yasuk I，Tomohikomor I.Structure－ function relationships of soy proteins.Food Proteins and Their Applications［M］.France:Institus Nationalde la Recherché Agromomique Center de Recherchéde Tours Nouzilly，1997:257－289.

［5］Oliver C M，Melton L D，Stanley R A.Creating proteins with novel functionality via the Maillard reaction:A review［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，2006，46:337－350.

［6］Jun－Jun Guan，Ai－Yong Qiu，Xiao－Ya Liu，et al.Microwave improvement of soy protein isolate－saccharide graft reactions［J］.Food Chemistry，2006，97:577－585.

［7］Shu W，Sahara S，Nakamura S.Effect of the length of polysaccharides chains on the functional properties of the maillard－polysaccharide conjugate［J］.Agric Food Chem，1996，44:2544－2548.

［8］Kobori T，Matsumoto A，Sugiyama S.pH － Dependent interaction between sodium caseinate and xanthan gum［J］.Carbohydrate Polymers，2009，75(4):719－723.

［9］Thanh V H，Okubo K，ShibasakiK.Isolation and characterization of the multiple 7S globulins of soybean proteins［J］.Plant Physiology，1975，56(1):19－22.

［10］Nagano T，Hirotsuka M，Mori H，et al.Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40(6):941－944.

［11］姜劍，遲玉杰，孫艷梅，等.分離β－伴大豆球蛋白和大豆球蛋白工藝研究［J］.食品科學，2011，32(6):13－15.

［12］朱曉燁，遲玉杰，劉紅玉.大豆蛋白7S和11S組分分離方法的優化［J］.食品工業科技，2011，32(7):267－269.

［13］Perace K N.Emulsifying properties of proteins evaluation of aturbidretric technique［J］.Journal of Agricultural and Food Charistry，1978(26):716－723.

［14］N Diftis，V Kiosseoglou.Improvementofemulsifying propertiesofsoybean protein isolate by conjugation with carboxymethyl cellulose［J］.Food Chemistry，2003，81:1－6.

［15］Brands C M J，van Boekel M A J S.Kinetic modelling of reactions in heated disaccharide－ casein systems［J］.Food Chemistry，2003，83:13－26.

［16］Alizadeh－Pasdar N，Li－Chan E C.Comparison of protein surface hydrophobicity measured at various pH values using three different fluorescent probes［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2000，48(2):328－334.

［17］Lowry O H，Rosebrough N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.The Journal of Biological Chemistry，1951，193:265－275.

［18］Fogliano V，Monti S M，Musella T，et al.Formation of coloured maillard reaction products in a gluten－glucose model system［J］.Food Chemistry，1999，66:293－299.