檸檬酸提取海帶渣中多糖及其抗氧化活性與結構的研究

盧茳虹，林宗毅，崔 春，游麗君，趙謀明

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

海帶屬于褐藻門(Phaeopayta)海帶目(Laminariales)海帶科(Laminariaceaae)海帶屬(Laminaria)的一種大型海藻，含有多種生物活性成分［1］。海帶多糖是存在于海帶細胞間和細胞內的一類天然生物大分子物質，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫和抗病毒等作用［2］。海帶多糖的多樣生物活性以及在功能性食品和藥品上的應用，使對其的開發利用和研究日益活躍。目前，熱水提取法是制備海帶多糖的主要方式，而提取完后的大量海帶渣將作為廢料丟棄。然而水提法耗能多，提取時間長，且多糖得率較低，故海帶渣中尚殘留有大量的多糖。因此，尋找一種有效的提取方法來最大程度地提取海帶渣中的多糖具有重要意義。酸提法可有效地降解多糖糖苷鍵，使更多的小分子量多糖分子溶解出來，提高多糖提取率和純度［3］。目前國內外研究酸提法的酸原料仍局限于鹽酸，且存在多糖降解程度難以控制等問題［4］。檸檬酸作為一種弱酸，可使整個提取過程都保持在一定酸度下進行，一方面可有效地降解殘留在海帶渣中的大分子物質，使多糖溶出，提高得率;另一方面有效降解部分糖苷鍵，提取具有較高活性的小分子多糖，提高多糖抗氧化活性［5］。先前的研究中已對檸檬酸提取海帶多糖的工藝及其抗氧化活性做了較詳盡的論述［6］。本文在此基礎上，以傳統水提后的海帶渣作為原料，采用檸檬酸提取法對海帶渣進行再次提取，并將海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖進行抗氧化與結構比較，以期為更好地開發利用海帶提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干海帶 采購于山東省煙臺，采收于九月，清洗后曬干，粉碎過40目篩，置于干燥器中儲存備用;DPPH(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazy)、ABTS(2，2－Azino－bis(3－ethylbenzothia－zoline－6－sulfonic acid))、Trolox、FL(Fluorescein)及 AAPH(2，2’－azobis(2－methylpropionamidine)－dihydrochloride) 美國Sigma公司;檸檬酸、氫氧化鉀、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸等 廣州精科試劑有限公司，分析純。

DFT200型手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;GT7C2A立式殺菌鍋 溫州市安福防腐機械廠;pHS－3EpH計 北京雷磁儀器公司;GL－21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;RE－52AA旋轉蒸發儀 上海生物有限公司;Unico UV－2000型紫外可見分光光度計 尤尼科儀器有限公司;Varioskan Flash多功能酶標儀 芬蘭Thermo Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖提取方法

1.2.1.1 水提后酸提法 海帶干粉→熱水提取(120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→過濾得海帶渣→烘干→檸檬酸提取(pH2檸檬酸溶液、120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→取上清液，用氫氧化鉀調pH至中性→濃縮→醇沉(乙醇最終濃度為80%)→4℃靜置8h→取沉淀物→復溶沉淀物→除蛋白、脫鹽→凍干→海帶渣多糖。

1.2.1.2 直接酸提法 海帶干粉→檸檬酸提取(pH2檸檬酸溶液、120℃、3h、料液比1∶30g/mL)→取上清液，用氫氧化鉀調pH至中性→濃縮→醇沉(乙醇最終濃度為80%)→4℃靜置8h→取沉淀物→復溶沉淀物→除蛋白、脫鹽→凍干→海帶多糖。

1.2.2 多糖測定 本實驗采用苯酚－硫酸法測定多糖提取率［7］。

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 將分析純葡萄糖105℃烘干至恒重，取葡萄糖100mg定容于1L容量瓶中，配制成濃度為100mg/L的葡萄糖標準溶液。精密移取葡萄糖標準溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL用蒸餾水將溶液補至2mL，加入6%苯酚溶液1mL，迅速加入5mL濃硫酸，充分振蕩搖勻后，室溫下放置20min，測定490nm處溶液的吸光值。以葡萄糖含量為橫坐標，對應吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2 多糖提取率的計算 多糖提取率(%)=提取液中多糖含量/所用海帶總量×100

1.2.3 氧自由基清除能力(ORAC值)的測定 參照Hua等［8］的方法并加以改進。FL(熒光素鈉鹽)、AAPH(自由基產生劑)、標準抗氧化物質Trolox(維生素E水溶性類似物)以及待測樣品均用75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.40)溶解和稀釋。具體操作為:在96孔板各微孔中分別加入緩沖溶液20μL、樣品20μL及FL(70nmol/L)20μL后，添加在37℃下預置15min，迅速在各孔中加入 AAPH(12.8mmol/L)140μL后運行程序，在37℃下以激發波長485nm，發射波長538nm進行連續測定，每2min測定一次各孔熒光強度，測定 120min，熒光強度分別記為 f0、f1、f2…f60。將記錄的各微孔不同時間點的絕對熒光強度數據fi與初始熒光強度f0相比，折算成相對熒光強度，并根據公式，統計熒光熄滅曲線下面積(AUCsample)值，然后根據公式Net AUC=AUCsample－AUCblank，分別計算不同濃度 Trolox(0～100μmol/L)和海帶多糖的Net AUC值，其中AUCblank為沒有抗氧化劑存在時自由基作用對照的AUC值。根據回歸方程計算得出兩種多糖的ORAC值，ORAC值以μmol Trolox/g表達。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測定 參照游麗君等［9］的方法并加以改進。配制 DPPH自由基溶液(0.2mmol/L，溶于無水乙醇)，DPPH自由基乙醇溶液在517nm處有紫色基團特征吸收峰，將多糖溶液按一定梯度稀釋。將2mL DPPH溶液置于試管中，加入2mL海帶多糖溶液，振蕩混勻，室溫避光放置30min后，在517nm處測其吸光值(Ai);以2mL無水乙醇加入2mL蒸餾水調零;對照為2mL DPPH溶液加上2mL無水乙醇在測定波長下的吸光值(Ac)，2mL海帶多糖溶液和2mL無水乙醇混合后在測定波長的吸光值為Aj。根據公式R(%)=［1－(Ai－Aj)/Ac］×100，計算清除率R。以0～100μmol Trolox清除DPPH自由基能力做標準曲線，兩種多糖樣品每個至少測定三個濃度并呈線性關系，計算平均Trolox當量。

1.2.5 ABTS自由基清除能力測定 參照游麗君等的方法并加以改進［9］。ABTS自由基儲備液的制備:以去離子水將ABTS和過硫酸鉀K2S2O8分別溶解并混合，使其終濃度分別為14mmol/L和4.9mmol/L，在室溫避光條件下靜置12～16h。測定時，將ABTS自由基儲備液以50%乙醇溶液稀釋，使其在734nm時吸光度達0.70±0.02，形成ABTS自由基測定液。取2.9mL ABTS自由基測定液，加入0.1mL樣品稀釋液或Trolox，準確振蕩30s，測定反應20min后在734nm處的吸光值。以0～200μmol Trolox的還原能力做標準曲線，兩種多糖樣品每個至少測定三個濃度并呈線性關系，計算平均Trolox當量。

1.2.6 還原力的測定 參照游麗君等［9］的方法并加以改進。樣品2mL加到2mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和2mL 1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液的混合液中。混合物在50℃保溫20min，然后在反應混合物中加入2mL 10%(w/v)的TCA，混合后以3000r/min離心10min，取上清液2mL與2mL蒸餾水以及0.4mL 0.1%(w/v)氯化鐵在反應試管中反應，10min后測定其在700nm處的吸光值。吸光值越大，表明該樣品的還原力越強。以0～300μmol Trolox的還原能力做標準曲線，兩種多糖樣品每個至少測定三個濃度并呈線性關系，計算平均Trolox當量。

1.2.7 分子量的測定 樣品的制備:將冷凍干燥后的兩種多糖溶于0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液，制成2.0mg/mL的溶液，以10000r/min高速離心機離心后去取上清液，采用凝膠滲透色譜(GPC)測定分子量。GPC色譜條件:進樣20μL，流動相為0.02mol/L磷酸二氫鉀溶液，流速為0.6mL/min，Waters 2410示差折光檢測器檢測。

1.2.8 紅外分析 稱取兩種提取方法的多糖1～2mg，用KBr混合壓片法在4000～500cm－1范圍進行紅外掃描。

2 結果與討論

2.1 海帶渣與海帶中的多糖提取率

由表1可知，檸檬酸提取法可從水提后的海帶渣中提取7.00%的多糖(根據葡萄糖標準曲線計算多糖提取率，回歸方程為y=6.5048x+0.0166，R2=0.997)，而直接酸提法具有較高的多糖提取率。海帶含有大量的褐藻酸鈉，又稱海帶膠，是一種親水性膠體，在傳統水提取條件下，提取液易呈凝膠狀，使多糖的溶解率偏低，故尚有大量的多糖殘留在海帶渣中。但由于酸的存在，褐藻糖膠易發生部分水解，提高多糖的溶出，從而可更大程度地從海帶中提取多糖。此外，選擇檸檬酸這種弱電離的有機酸，可有效地控制多糖水解程度。

表1 海帶渣與海帶中的多糖的提取率Table 1 The extraction yieldof Laminaria japonica and its residue

2.2 海帶渣多糖與海帶多糖抗氧化能力比較

由表2可知，在氧自由基吸收能力(ORAC)、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力與還原力這四種抗氧化能力指標中，水提后酸提的海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖的抗氧化能力相似，且兩種提取方式的多糖ORAC值均比抗氧化劑BHT高。

氧自由基清除能力分析法是一種基于氫原子轉移(HAT)的方法，一般認為基于HAT機制的方法最接近生理環境真實氧化過程，是目前抗氧化研究領域最受關注的評價方法之一［10］。根據Net AUC值與Trolox濃度建立的直線回歸方程為:y=0.3325x+4.174(R2=0.9903)。由表2可知，海帶渣多糖的ORAC值為 130.13μmol Trolox/g，是海帶多糖的ORAC值的91.31%，且是抗氧化劑BHT的2倍多。Hua等［8］人研究長裙竹蓀多糖的體外抗氧化能力發現，長裙竹蓀多糖的ORAC值為115.77μmol Trolox/g。實驗結果表明，兩種提取方式下的海帶多糖均具有較好的氧自由基清除能力，且海帶渣多糖與海帶多糖的ORAC值無明顯差別。DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力分析法均是基于電子轉移(ET)的方法，是檢測樣品抗氧化活性的常用方法，具有快速、簡便、經濟等優點［11］。由表2可知，兩種提取方式的多糖在這三種抗氧化指標上結果相近。其中，海帶渣多糖的DPPH自由基清除能力是海帶多糖的92%;海帶渣多糖ABTS自由基清除能力是海帶多糖的77.2%，差別稍大;海帶渣多糖的還原力是海帶多糖的95.16%。研究表明，海帶渣多糖在抗氧化能力上與海帶多糖相當，兩種提取方式的多糖均具有較好的抗氧化活性。

表2 水提后酸提的海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖抗氧化能力(μmol Trolo×/g)Table 2 The antioxidant activities of polysaccharides by citric acid extraction after water extraction(μmol Trolo×/g)and direct citric acid extraction

2.3 海帶渣多糖與海帶多糖分子量比較

水提后酸提的海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖的凝膠色譜圖如圖1所示。海帶渣多糖主要洗脫出兩個峰，其中峰1的平均分子量為310182u，占2.73%，峰2的平均分子量為30515u，占97.27%，是海帶多糖分子量的1.8倍，表明海帶渣多糖可能至少含有兩種不同分子量的多糖。而直接酸提的海帶多糖只洗脫出一個主峰，平均分子量為17122u。多糖的結構與生物活性存在一定關系，Hou等人［12］發現多糖的分子量對其抗氧化活性起著重要的作用，經雙氧水降解的低分子量海帶多糖具有更好的清除自由基能力。通過輻照獲得的低分子量海帶多糖可顯著地提高抗氧化活性［13］。本實驗主要采用檸檬酸提取法，由于酸的作用，多糖的糖鏈被有效地降解，故兩種多糖的主要分子量均小于海帶天然大分子量多糖(平均分子量為 150000u)［14］。實驗證明，海帶渣多糖的抗氧化活性略比海帶多糖的低，而其分子量比海帶多糖的高，這結果也進一步驗證了低分子量多糖具有較高的抗氧化活性。

2.4 海帶渣多糖與海帶多糖的紅外光譜結果比較

圖1 水提后酸提的海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖的分子量Fig.1 The molecular weight of polysaccharides extracted by citric acid extraction after water extraction and direct citric acid extraction

水提后酸提的海帶渣多糖和直接酸提的海帶多糖的紅外光譜比較相似，在4000～400cm－1區間有多糖類物質的一般特征吸收峰，如圖2所示。海帶渣多糖與海帶多糖在3045cm－1的強烈吸收峰為O－H的伸縮振動，屬于分子內氫鍵的吸收峰。在2930、2929cm－1的小尖峰為糖類C－H的伸縮振動。海帶渣多糖在 1607、1416、1298、1034cm－1處與海帶多糖在1605、1413、1298、1038cm－1處的吸收峰為 C=O 非對稱伸縮振動、C－O伸縮振動和O－H變角振動，屬于羧基的特征峰，表明可能含有糖醛酸［15］。在1257、1259cm－1的吸收峰為－O－SO3－的 S=O 伸縮振動，說明多糖可能含有硫酸基［16］。在 889、890cm－1處的吸收峰為β－端基差向異構的C－H變角振動，為吡喃環的特征吸收峰;817、819cm－1處的吸收峰是半乳吡喃糖的特征峰;此外，930～960cm－1區域為糖的吡喃環的振動譜。這幾個尖峰表明海帶渣多糖和海帶多糖均為吡喃糖。紅外光譜圖表明兩種提取方式下的多糖具有相似的結構，具體的結構特點(如單糖組成、硫酸基含量、糖醛酸含量等)還有待進一步研究。

圖2 水提后酸提的海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of polysaccharides extracted by citric acid extraction after water extraction and direct citric acid extraction

3 結論

3.1 以水提后的海帶渣為原料，采用檸檬酸提取法進行再次提取，可提高海帶提取多糖的利用率。水提后酸提的海帶渣多糖的抗氧化活性與直接酸提的海帶多糖相當，具有較好的氧自由基清除能力、DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力，其中ORAC值比抗氧化劑BHT高2倍。

3.2 對水提后酸提的海帶渣多糖進行分子量測定與紅外光譜圖分析，結果表明海帶渣多糖與直接酸提的海帶多糖結構相似，具體結構特點(如單糖組成、硫酸基含量、糖醛酸含量等)有待進一步研究。此外，低分子量多糖的高活性特點與其結構的關系也值得進一步探討。

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