杜仲內生真菌代謝產物對大腸桿菌的作用機理研究

姜交龍，張 濤，江 波，沐萬孟，繆 銘

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)始載于《本草綱目》，是一種落葉喬木，為單科單屬單種的稀有刁遺植物，有“活化石植物”之稱，是我國傳統的名貴中藥材，屬于國家二類保護植物［1］。研究表明，杜仲各組織中含有如綠原酸、京尼平甙、桃葉珊瑚甙等成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用［1－3］。植物內生真菌是指生長在健康植物體的根、莖及葉等組織中的細胞間隙或者細胞內的一類真菌，是植物微生態系統的重要組成部分［4－6］。內生真菌幾乎存在于所有目前已經研究過的植物之中。近年來的研究發現:生活在植物體的內生真菌能產生與宿主相同或者相似的具有生理活性的代謝產物［7－9］。因此，開發和利用植物內生真菌在保護植物物種資源、探索新的產物等方面都有著重要的意義。本文以從杜仲中篩選到的一株具有較高抑菌活性的內生真菌Y18為出發菌株，研究其代謝產物對大腸桿菌細胞膜通透性、全細胞蛋白質以及核酸結構等方面的影響，為內生真菌資源開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碘化丙啶(PI) 北京泛博生化公司;乙酸乙酯等 分析純;大腸桿菌 本實驗室保存;大腸桿菌培養 LB培養基(蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1L);真菌活化培養 PDA培養基(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，水1L);發酵培養 察氏培養基(蛋白胨 10g、蔗糖 30g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、水 1L);杜仲內生真菌 Y18自行篩選，分離步驟［6－7］:取健康的杜仲葉，洗凈晾干，在無菌的條件下用75%的乙醇浸泡3min，然后用無菌水漂洗;再用2%的NaClO溶液漂洗2min，最后用無菌水漂洗3次，風干;將表面消毒處理后的杜仲葉剪成1cm左右的小塊，加入到含有青霉素的PDA培養基內，28℃下培養，待切口處長出菌絲，挑至新鮮的PDA培養基中，采用菌絲頂端純化法逐步純化。

BD FACS Calibur流式細胞分選儀 美國BD公司;NICOLET NEXUS 470傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo Electron;YSI3200電導儀 美國YSI。

1.2 實驗方法

1.2.1 內生真菌Y18代謝產物制備 將內生真菌轉接于 PDA固體培養基，28℃活化2d，然后接種于250mL三角瓶中(含PDA液體培養基50mL)，28℃，150r/min培養3d，作為種子培養基。以5%(v/v)接種量轉入500mL三角瓶中(含察氏培養基200mL)，28℃，150r/min培養7d。發酵結束后，過濾除去菌絲體。濾液用等體積的乙酸乙酯分3次萃取，合并有機相，于旋轉蒸發儀上濃縮至浸膏，60℃烘干稱重，用無菌水溶解制成100mg/mL，備用。

1.2.2 Y18 代謝產物對細胞膜滲透性的影響［10－11］取對數生長期的大腸桿菌，4℃、6000r/min離心3min。用5%的葡萄糖溶液洗滌2次，重懸，分成多個等分備用。取4mL配好的菌懸液與1mL Y18代謝產物作用一段時間，離心取上清液測電導率。0min時的電導率記為L1，作用一段時間后記為L2;將4mL菌懸液與1mL蒸餾水煮沸5min，冷卻離心取上清液，測電導率為L0。相對電導率為:(L2－L1)/L0。

1.2.3 流式細胞儀分析細菌細胞膜完整性 將培養至對數期的大腸桿菌4℃、6000r/min離心3min，用0.85%的無菌生理鹽水洗滌2次，重懸、稀釋至菌體濃度為108～109cfu/mL左右，備用。取4mL菌液加入1mL Y18代謝產物，37℃培養，以生理鹽水為陰性對照。在處理前后的樣品中均加入PI至終濃度為50μg/mL，37℃避光培養30min 后，4℃、6000r/min 離心3min，用無菌生理鹽水洗滌2次除去過量的PI，用流式細胞儀 FACS Calibur檢測［12］。

1.2.4 全細胞蛋白變性情況分析 樣品處理方法同1.2.3。取500μL樣品平鋪于ZeSe晶體片上，在常溫下烘干，使其形成一層均勻的菌膜。使用FT－IR光譜檢測儀進行檢測，檢測方法為衰減全反射法。操作參數為:檢測波數范圍為4000～500cm－1，分辨率4cm－1，掃描次數32次。紅外光譜采用OMNIC軟件進行分析［13－16］。

2 結果與討論

2.1 Y18代謝產物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響

Y18代謝產物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響如圖1所示，作用4h后，相對電導率增大了16.22%，說明菌懸液中的離子濃度變大，推測大腸桿菌細胞膜的通透性受到了影響，細胞內離子的泄漏，從而使得相對電導率增大。

2.2 流式細胞儀分析細菌細胞膜完整性

圖1 Y18代謝物對大腸桿菌菌懸液電導率的影響Fig.1 Effect of the metabolites of Y18 on the relative electric conductivity

PI是一種DNA結合性染料，它可以鍥入雙鏈核苷酸中，使其在635nm附近發射紅色熒光而被流式細胞儀檢測。PI無膜通透性，不能透過完整結構細胞膜。因此，PI標記的細胞可以視為細胞膜損傷的細胞［12］。由圖2可知，Y18代謝產物處理前 E.coli(圖a)PI標記為陰性，表明處理前E.coli細胞膜完整。經過Y18代謝產物處理后(圖b～圖d為分別處理1、2、4h)，E.coli細胞不同程度被 PI染色，表明Y18代謝產物破壞了細胞膜的完整性，細胞膜通透性增強，PI進入細胞內部，從而與DNA結合，被FCM檢測到熒光。由圖3可知，經過4h后，陽性細胞的比例達到25.31%。

圖2 Y18代謝物處理的E.coli PI染色FCM熒光直方圖Fig.2 The fluorescence historgrams of E.coli cells stained by PI in the metabolites treatments

2.3 紅外光譜二階導數處理

FT－IR光譜技術作為一種綜合檢測細菌生理狀態的有效方法，近年來得到廣泛地應用［13－15］。圖4是處理前后大腸桿菌的紅外圖譜。由圖可知，處理前后圖譜的變化微小，從原始紅外圖譜中無法準確分辨出峰位的變化。通常要對其進行處理，解析圖譜中包含的信息。常用的數據處理方法有二階導數處理和去卷積處理［15－16］。

圖3 Y18代謝物處理后E.coli PI陽性細胞比例Fig.3 The percentage of PI－stained E.coli in the metabolites treatments

圖4 處理前后大腸桿菌紅外圖譜Fig.4 Representative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

圖5a是大腸桿菌在1700～1600cm－1下的二階導數圖譜。在紅外光譜中，1700～1600cm－1代表蛋白物質酰胺 I帶 C=O伸縮振動。其中，1682cm－1和1674cm－1的峰代表 β 轉角，1660cm－1處的峰代表無規轉曲，1644cm－1的峰代表 α 螺旋，1638cm－1和1630cm－1的峰代表 β 折疊［15］。由圖5a可見，處理后大腸桿菌細胞蛋白質結構發生變化，其中全細胞蛋白β折疊(1638cm－1和1630cm－1)變化得最為明顯;圖 5b 中，處理前后在 2957、2919、2872cm－1波數處發生了明顯的變化，這三處吸收峰分別代表著CH3反對稱伸縮振動、CH2反對稱伸縮振動以及CH3對稱伸縮振動，主要反映的是細胞膜的變化。這也進一步說明了處理后大腸桿菌細胞膜結構被破壞;圖5c中1220、1120cm－1的吸收峰發生了明顯的變化，這兩處的峰分別代表著核酸骨架中的P=O反對稱伸縮振動和C－C反對稱伸縮振動，主要反映了大腸桿菌細胞核物質結構的變化，說明處理后大腸桿菌細胞內的核酸物質遭到一定程度的破壞。通過對二階導數譜圖分析可知，處理后的大腸桿菌細胞膜、蛋白質和核酸結構均遭到一定的破壞。

2.4 全細胞蛋白變性情況分析

從二階導數譜圖中可以看出，處理后大腸桿菌全細胞蛋白結構發生了變化，其中蛋白 β折疊(1638cm－1和1630cm－1)變化得最為明顯。為了進一步對全細胞蛋白變性情況進行定量分析，采用PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶進行擬合［15－16］。

圖6左圖表示了處理前后紅外原始圖譜(上)、二階導數圖譜(中)和去卷積圖譜(下)。二階導數圖譜的峰形向下，去卷積圖譜峰形向上。結合兩種譜圖共同分析，當某個波數下在兩圖譜中都有吸收峰對應時，說明此吸收峰的可信度較高。根據文獻報道［14－16］，可以總結蛋白質酰胺Ⅰ帶區 β 轉角(1674、1683、1688cm－1)、無規卷曲結構(1660、1667cm－1)、α螺旋結構(1644、1652cm－1)和 β 折疊結構(1609、1618、1624、1630、1635cm－1)及對應的吸收峰波數。通過圖6可知，大腸桿菌在處理前后二階導數圖譜和去卷積圖譜對應較好，可以明顯的分辨出上述12個吸收峰。

圖5 處理前后大腸桿菌二階導數圖譜Fig.5 Representative second－derivative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

結合二階導數譜和去卷積譜，通過PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶進行擬合［15］。結果如表1所示，蛋白結構變化主要是β折疊增加，由處理前的34.60%增加到41.47%，變化最為明顯。α螺旋、無規卷曲、β轉角結構均有降低，其中，無規卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最為明顯。

表1 處理前后對大腸桿菌蛋白質酰胺Ⅰ帶二級結構的定量分析Table 1 Quantitative estimation of the secondary structures of proteins of control and treated samples of E.coli

3 結論

圖6 處理前后大腸桿菌酰胺Ⅰ帶二階導數去卷積譜以及擬合譜圖Fig.6 The second－derivative spectra and the amideI of protein fitting bands of control and treated samples of E.coli

本文通過對大腸桿菌細胞膜通透性、全細胞蛋白質以及核酸結構等檢測，分析杜仲內生真菌Y18代謝產物對大腸桿菌作用的機理。通過上述實驗，可以得出如下結論:內生真菌Y18代謝產物對大腸桿菌細胞膜影響比較明顯。處理4h后，大腸桿菌菌液相對電導率為16.22%，PI陽性細胞的比例達到25.31%。PI是一種DNA結合性染料，PI無膜通透性，不能透過完整結構細胞膜，因此，PI陽性細胞表明其細胞膜受到損傷。細胞膜的損傷導致細胞內物質流出，所以相對電導率增大。從二階導數譜中可以看出，全細胞蛋白質結構發生了明顯的變化。蛋白結構變化主要是β折疊增加，由處理前的34.60%增加到41.47%;α螺旋、無規卷曲、β轉角結構均有降低，無規卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最為明顯。從二階導數譜中可以看出，1220cm－1和1120cm－1的吸收峰發生了明顯的變化，這兩處的峰分別代表著核酸骨架中的P=O反對稱伸縮振動和C－C反對稱伸縮振動，主要反映了大腸桿菌細胞核物質結構的變化。

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