交聯(lián)殼聚糖對(duì)牛血清蛋白的吸附及釋放行為

劉 麒，禹雪晴，荊迎軍，夏文晨，楊景濤

(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津300130)

目前，我國(guó)對(duì)工業(yè)廢水的處理越來越重視，其中食品工業(yè)廢水的排放量較大，廢水中含有大量的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接排放不僅對(duì)環(huán)境造成污染，也造成了有用物質(zhì)的浪費(fèi)［1］，所以對(duì)廢水中蛋白類物質(zhì)的去除和回收成為研究熱點(diǎn)之一。吸附法由于具有工藝簡(jiǎn)單、投資少和不易產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)［2］，比較適合廢水中蛋白質(zhì)的去除和回收，而吸附法的關(guān)鍵問題之一就是篩選高效吸附劑。殼聚糖(CTS)是自然界中最豐富的天然聚合物之一，具有良好的生物降解性、生物相容性、無毒無害［3］。由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，在環(huán)保、生物和醫(yī)用等行業(yè)具有良好的應(yīng)用價(jià)值，有望成為蛋白類廢水的生物吸附劑之一。酸性環(huán)境有利于殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的吸附行為，但在低pH下，殼聚糖易于降解，限制了它的應(yīng)用。本文以天然高分子殼聚糖為原料，與多聚磷酸鈉和環(huán)氧氯丙烷通過離子和共價(jià)作用改性形成交聯(lián)殼聚糖(CL－CTS)，提高了殼聚糖對(duì)低酸體系的耐受度并有利于重復(fù)利用［4］，在此基礎(chǔ)上研究了CL－CTS對(duì)蛋白的吸附性能，將為今后殼聚糖在蛋白廢水處理方面的應(yīng)用和研究提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 脫乙酰度為90%，購(gòu)自天津市久康生物工程開發(fā)有限公司;牛血清蛋白(BSA) 購(gòu)自天津鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;多聚磷酸鈉、環(huán)氧氯丙烷、氯化鈉等 均為分析純，購(gòu)自天津贏達(dá)稀貴試劑公司。

722N可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HZS－H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;BS 124S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CL－CTS的制備 將殼聚糖溶于1%的乙酸中配成2.5%的殼聚糖－乙酸溶液，攪拌均勻備用;用注射器依靠自然重力將殼聚糖－乙酸溶液滴落于1%的多聚磷酸鈉溶液中，進(jìn)行初次離子交聯(lián)反應(yīng)并成球;4h后用雙蒸水將小球洗凈并將其放入50mL、1mol/L的NaOH溶液中，加入0.2mL的環(huán)氧氯丙烷，在30℃下水浴振蕩進(jìn)行二次共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，2h后用雙蒸水反復(fù)洗滌至體系的pH為7.0，即得到CL－CTS。

1.2.2 吸附量和吸附率的測(cè)定 在278nm下測(cè)定蛋白殘余量，然后根據(jù)式(1)和式(2)計(jì)算吸附量與吸附率。

式中，Q:吸附量，mg/g;η:吸附率，%;C0:BSA的初始濃度，mg/mL;Ce:BSA的平衡濃度，mg/mL;M:CL－CTS 的干重，g;V:溶液的體積，mL。

1.2.3 BSA初始濃度對(duì)吸附效果的影響 取1.0g CL－CTS置于pH7.0不同濃度的BSA溶液中，30℃恒溫水浴振蕩2h后測(cè)定CL－CTS對(duì)BSA的吸附性能。

1.2.4 CL－CTS用量對(duì)吸附效果的影響 取不同用量的CL－CTS置于pH7.0濃度為0.2mg/mL的BSA溶液中，30℃恒溫水浴振蕩2h后，測(cè)定其吸附效果。

1.2.5 pH對(duì)吸附效果的影響 稱取1.3g CL－CTS置于濃度為0.2mg/mL、不同pH的BSA溶液中，30℃恒溫水浴振蕩2h后，測(cè)定其吸附效果。

1.2.6 吸附條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化BSA初始濃度、CL－CTS用量、pH。正交因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.7 吸附等溫線的繪制 稱取1.3g CL－CTS置于pH5.0、不同濃度的BSA溶液中，一定時(shí)間后，測(cè)定蛋白的殘余量，繪制吸附等溫線。

1.2.8 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 稱取1.3g CL－CTS加入到pH5.0、濃度為0.2mg/mL的BSA溶液中，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間后溶液中蛋白的殘余量，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.9 蛋白質(zhì)的釋放及CL－CTS的再利用 在進(jìn)行解吸處理之前，探討了離子強(qiáng)度對(duì)吸附行為的影響，然后根據(jù)此原理，利用一定濃度的中性鹽對(duì)吸附飽和后的CL－CTS小球進(jìn)行解吸處理［5］。

2 結(jié)果與討論

2.1 CL－CTS的電鏡掃描

殼聚糖的分子鏈上含有大量的游離氨基和羥基，正因?yàn)檫@些基團(tuán)的存在，使殼聚糖易于發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。如圖1，殼聚糖與多聚磷酸鈉交聯(lián)內(nèi)部形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠型分子，加強(qiáng)了殼聚糖的溶脹性以及吸附性能。

2.2 BSA初始濃度對(duì)吸附效果的影響

圖1 交聯(lián)殼聚糖的電鏡掃描圖Fig.1 SEM micrograph of CL－CTS

結(jié)果如圖2所示，在BSA初始濃度較低的范圍內(nèi)，吸附率呈上升趨勢(shì)，然后隨著濃度的增大，吸附率逐漸降低。在吸附初始階段，由于殼聚糖的表面積效應(yīng)和體積效應(yīng)，并且存在大量的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致吸附速率上升較快。然后隨著濃度的增大，殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的吸附達(dá)到飽和，吸附率達(dá)到最大值后開始下降。

圖2 BSA初始濃度對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effect of BSA concentration on the adsorption rate

2.3 CL－CTS用量對(duì)吸附效果的影響

CL－CTS用量對(duì)吸附效果的影響見圖3。隨著殼聚糖用量的增加，吸附率逐漸增大至平衡。這主要是由于CL－CTS用量的增加，分子鏈中游離的氨基較多，提供了較多的吸附位點(diǎn)，吸附性能大大增加，當(dāng)吸附達(dá)到飽和以后，吸附率趨于平衡。

圖3 交聯(lián)殼聚糖的用量對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of CL－CTS dosage on the adsorption rate

2.4 pH對(duì)吸附效果的影響

pH是影響吸附效果的一個(gè)重要參數(shù)。圖4表明，最大平衡吸附率出現(xiàn)在pH5.0附近(BSA等電點(diǎn))，在pH低于或高于BSA的等電點(diǎn)時(shí)，由于靜電排斥作用，導(dǎo)致吸附率下降。在pH等于BSA的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)上沒有凈電荷，吸附效果最好。

2.5 吸附條件的優(yōu)化

由以上的結(jié)果可知，BSA初始濃度、CL－CTS用量、pH在吸附過程中均起一定的作用。為了確定最佳的工藝操作參數(shù)，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)吸附體系的影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表3 Langmuir，F(xiàn)reundlich方程參數(shù)Table 3 Langmuir，F(xiàn)reundlich isotherm constants

圖4 pH對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of pH on the adsorption rate

表2 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，極差R可以確定因素對(duì)指標(biāo)影響的大小。極差越大，說明該因素的影響越顯著。由表2可知，對(duì)BSA吸附效果的影響主次為:pH＞CL－CTS用量＞BSA初始濃度;正交優(yōu)化后的最優(yōu)操作條件為 A2B2C3:BSA的初始濃度為0.2mg/mL，CL－CTS的用量為1.3g，pH5.0，此時(shí)吸附率達(dá)到88.7%。

2.6 吸附等溫線

一定溫度下，研究了不同蛋白質(zhì)濃度對(duì)平衡吸附量的影響。隨著蛋白質(zhì)濃度的增大，吸附量在逐漸增大，直至吸附達(dá)到平衡。吸附等溫線能夠進(jìn)一步描繪吸附劑與被吸附物之間的反應(yīng)過程，Langmuir和 Freundlich模型常用來表征平衡吸附曲線［6］。

Langmuir等溫吸附方程的線性表達(dá)式:

式中，C:蛋白質(zhì)的平衡濃度，mg/mL;Q:平衡吸附量，mg/g;Qe:飽和吸附量，mg/g;b:平衡常數(shù)，mL/mg。

Freundlich等溫吸附方程的線性表達(dá)式:

式中，C和 Q意義同式(3)，nF和 kF分別為Freundlich參數(shù)。

圖5和圖6分別為CL－CTS吸附BSA的Langmuir和Freundlich等溫吸附曲線，參數(shù)見表3。Langmuir模型假設(shè)吸附是單分子層的，表面均一且表面吸附能相等。相對(duì) Langmuir模型而言，F(xiàn)reundlich模型更適合描述CL－CTS對(duì)BSA的吸附過程，這說明吸附過程接近于多分子層吸附理論，吸附劑的表面是不均一的，交聯(lián)殼聚糖分子中的每一個(gè)吸附位置能夠吸附多個(gè)蛋白質(zhì)分子，當(dāng)所有的吸附位置達(dá)到飽和后，吸附達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。kF反映體系中可以表征吸附量的大小，nF表示吸附作用的強(qiáng)度，nF＞1，說明是優(yōu)惠吸附，吸附強(qiáng)度較大。

圖5 Langmuir等溫吸附方程曲線Fig.5 Langmuir adsorption isotherm

圖6 Freundlich等溫吸附方程曲線Fig.6 Freundlich adsorption isotherm

2.7 吸附動(dòng)力學(xué)

在最優(yōu)的條件下，進(jìn)行吸附反應(yīng)，用得到的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)方程擬合，可以提供吸附機(jī)理的相關(guān)信息。明確吸附機(jī)理是優(yōu)化設(shè)計(jì)和選擇正確吸附方法的基礎(chǔ)。偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型［7］如下:

式中，Qe、Qt分別為平衡時(shí)間和時(shí)間t時(shí)的吸附量，mg/g;k1:偽一級(jí)吸附速率常數(shù)，min－1;t:吸附時(shí)間，min。

以吸附量隨時(shí)間變化作曲線，按照偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行擬合的R2值比較低(見圖7和表4)，因而進(jìn)一步用偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程［8］進(jìn)行處理，結(jié)果見圖8和表4。偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型如下:

表4 吸附動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 4 Adsorption kinetic parameters

式中，k2:偽二級(jí)吸附速率常數(shù)，g/(mg·min)。

圖7 偽一級(jí)吸附方程曲線Fig.7 Pseudo－first order plot for adsorption

圖8 偽二級(jí)吸附方程曲線Fig.8 Pseudo－second order plot for adsorption

由于殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)，通常用顆粒擴(kuò)散速率方程表明吸附速率，能進(jìn)一步了解吸附作用所涉及到的某些機(jī)制和限制因素。顆粒擴(kuò)散速率方程［9］的表達(dá)式為:

式中，ki:顆粒吸附速率常數(shù)，mg/(g·min1/2);t:吸附時(shí)間，min。

根據(jù)顆粒速率方程擬合的圖形，如果是一條直線，則表明殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的吸附過程主要是由內(nèi)擴(kuò)散控制的;若是多線性的，則顯示有兩個(gè)或三個(gè)階段影響吸附過程。圖9表明了顆粒擴(kuò)散速率方程的擬合曲線是多線性的，第一階段代表了大孔隙擴(kuò)散，速率常數(shù)定義為ki，1;第二階段代表了微孔擴(kuò)散，速率常數(shù)定義為 ki，2。由表 4 可知，ki，1＞ ki，2，在吸附初期，由于蛋白質(zhì)的分子量大和空間尺寸分布太寬，蛋白質(zhì)主要被交聯(lián)殼聚糖的大孔隙吸附，吸附后期主要在吸附劑微孔內(nèi)部吸附，擴(kuò)散阻力逐步增大且濃度推動(dòng)力越來越小，吸附速率逐漸減緩。在顆粒擴(kuò)散方程中存在截距，可能的原因之一是由液膜所形成的邊界層影響了交聯(lián)殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的吸附過程。

圖9 顆粒擴(kuò)散速率方程曲線Fig.9 Intraparticle diffusion kinetics plot

由表4中的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)以及相關(guān)系數(shù)的數(shù)據(jù)可以看出偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2相對(duì)較低，而偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型的R2較高，達(dá)到0.99以上，更能較好地表征交聯(lián)殼聚糖對(duì)蛋白質(zhì)的吸附行為，且擬合方程計(jì)算得出的平衡吸附量Qe與吸附動(dòng)力學(xué)曲線的Qe基本吻合。說明CL－CTS對(duì)BSA的吸附主要受化學(xué)控制，而不是物質(zhì)傳輸步驟控制。

2.8 蛋白質(zhì)的釋放及CL－CTS的再利用

解吸研究對(duì)于表明吸附劑與被吸附物之間的穩(wěn)定性與可再生性至關(guān)重要［10］。無機(jī)鹽離子對(duì)CLCTS吸附BSA的過程起抑制作用，隨著離子強(qiáng)度的加大，吸附率在逐漸下降，而且在相同的離子強(qiáng)度下，各種離子的抑制吸附效果是不同的(見圖10)。這可能是由于離子強(qiáng)度的增加使BSA分子處于較多離子氛圍中，增大了靜電排斥作用，影響了BSA的分子構(gòu)象，破壞了殼聚糖分子與BSA分子之間的靜電作用力，然后只通過范德華力吸附小部分BSA分子，使得吸附效果呈下降趨勢(shì)，而且鹽離子也可能與殼聚糖分子中的某些基團(tuán)相結(jié)合，使得殼聚糖與BSA分子結(jié)合的空間受阻［11］。且由圖可知，NaCl對(duì)殼聚糖吸附BSA的過程抑制作用較強(qiáng)，更易與殼聚糖分子相結(jié)合。因此，選用NaCl作為解吸劑，探討其對(duì)蛋白質(zhì)的釋放行為。

圖10 離子強(qiáng)度對(duì)吸附率的影響Fig.10 Effect of ionic strength on the adsorption rate

取吸附飽和后的CL－CTS，置于3g/L的NaCl溶液中進(jìn)行解吸，負(fù)載CL－CTS上的蛋白質(zhì)被釋放出來，然后將CL－CTS再次進(jìn)行吸附BSA的實(shí)驗(yàn)，考察重復(fù)使用效果，結(jié)果見表5。經(jīng)過4次洗脫周期后，吸附率下降了18.6%，隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加，基本維持在這個(gè)水平。這表明NaCl對(duì)負(fù)載牛血清蛋白的殼聚糖洗脫效果較好。

表5 交聯(lián)殼聚糖的重復(fù)使用性Table 5 Reuse of cross－linked chitosan

3 結(jié)論

采用多聚磷酸鈉和環(huán)氧氯丙烷制備的交聯(lián)殼聚糖，增加了殼聚糖空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使電荷更集中，通過靜電引力提高了吸附能力。通過對(duì)吸附條件的優(yōu)化，在pH5.0，交聯(lián)殼聚糖的用量為1.3g，BSA的初始濃度為0.2mg/mL時(shí)，吸附率可達(dá)到88.7%，吸附過程可用偽二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型來描述，并符合Freundlich等溫吸附模型。NaCl溶液對(duì)負(fù)載蛋白的CL－CTS洗脫效果較好，可以達(dá)到循環(huán)利用的效果。因此，殼聚糖作為一種功能材料，探索其在食品工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

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