溫度對加曲速釀低鹽魚露性質的影響

翁武銀，陳書霖，劉光明，蘇文金，曹敏杰

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

魚露是我國沿海地區及東南亞地區自古以來利用魚貝類制造的水產發酵調味品。傳統魚露的生產工藝是在低值魚中添加30%以上的食鹽，通過腌漬和日曬夜露進行天然發酵［1］，高濃度的鹽雖然可以防止魚體在發酵過程中腐敗變質、抑制細菌的生長繁殖，但同時也嚴重抑制了魚肉內源性蛋白酶的活力，導致魚肉自溶和蛋白分解速度下降，大大延長了發酵周期［2］。此外，傳統魚露還具有一定的腥臭味，限制了魚露產品在內陸市場的推廣。因此，隨著人們消費水平的提高以及飲食習慣的改變，具有良好風味的低鹽魚露已成為社會發展的主流方向。為了縮短魚露發酵周期，近年來研究報道的快速發酵方法主要有超高壓水解法［3］、外加蛋白酶［4］和富含蛋白酶的內臟發酵［5］、外加曲發酵［6］，以及加酸減鹽發酵［7］等。其中，外加曲發酵魚露是在天然發酵的基礎上通過添加醬油曲，利用曲種繁殖時分泌的各種蛋白酶分解魚肉。該工藝不僅可以縮短魚露發酵周期，還能改善魚露的風味，相對其它快速發酵方法，將具有更好的應用前景。然而，外加曲發酵的低鹽魚露與低鹽醬油類似［8］，在發酵過程中醬醅表面有時會發生霉變出現菌膜，使魚露品質下降。據報道，發酵溫度直接影響醬醅中微生物的種類、數量和酶的活力，甚至也會影響魚露產品的風味和滋味［9］。然而，有關溫度對加曲速釀低鹽魚露的影響尚未見報道。本研究以低值海洋魚類藍圓鲹為原料，通過添加醬油曲，考察在發酵過程中發酵溫度對低鹽魚露理化性質的影響，以期為魚露的加曲速釀工藝投入實際生產提供更多的參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍藍圓鲹 福建廈門集美農貿市場，魚體平均重量為100g左右，平均體長為25cm左右;醬油曲(Aspergillus oryzae) 日本釀造工業株式會社;濃硫酸、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司;硫酸銅上海久億化學試劑有限公司;甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀 廣東西隴化工廠;硼酸、無水碳酸鉀 上海試劑總廠;硝酸銀 上海申博化工有限公司。

Avanti JA－25高速冷凍離心機 美國Beckman公司;WB－10L1恒溫水浴鍋 德國Memmert公司;PSX智能型恒溫箱 寧波萊福科技有限公司;877型自動電位滴定儀 瑞士萬通中國有限公司;L－8900氨基酸自動分析儀 日本Hitachi High－Technologies公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵 將半解凍狀態的整條藍圓鲹利用攪碎機絞碎，絞碎的藍圓鲹與醬油曲、鹽、水按1∶0.1∶0.225∶0.5的質量比混合，攪拌均勻制成醬醅，分別放置于20、30、40℃恒溫箱中恒溫發酵90d，期間定期取樣進行分析檢測。

此外，將醬醅放置于20℃恒溫箱中保溫發酵30d后，再利用30℃保溫發酵60d，記為20－30℃分段保溫發酵;而20－30－40℃保溫發酵是將醬醅放置于20℃下保溫發酵30d后，依次在30、40℃下各繼續發酵30d。

1.2.2 魚露樣品的制備 舀取一定質量的發酵醬醅，利用高速冷凍離心機離心(10000×g，4℃)30min，將獲得的上清于85℃下水浴15min，用碎冰迅速冷卻后，再離心(10000×g，4℃)15min去掉不溶性物質，制備成魚露樣品。

1.2.3 魚露理化指標測定 醬醅pH的測定:采用pH計直接測定。

可溶性總氮(TS－N)的測定:采用凱氏定氮法測定［10］。

氨基酸態氮(AA－N):用自動電位滴定儀，甲醛滴定法測定［10］。

揮發性鹽基氮(TVB－N):采用康維皿法(微量擴散法)測定［11］。

游離氨基酸分析:經濾紙過濾后的魚露用蒸餾水稀釋500倍后，利用氨基酸自動分析儀測定魚露中的游離氨基酸含量。

感官評價:在Fukami等［12］感官評價方法基礎上有所改動:取10mL魚露在室溫下靜置30min，用商品魚露作為對照，感官評價小組由10人組成(5男5女，年齡在20～35歲)，在感官評價前，先多次進行風味描述的一致認定和培訓，然后對魚露的氣味(魚腥味、醬香味、肉香味、胺味)和滋味(苦味、酸味、鮮味)進行感官評價，滿分為10分，具體標準如表1所示。

1.2.4 數據統計與分析 所有數據采用SPSS16.0軟件(SPSS Inc，Chicogo，IL，USA)分析，用 ANOVA 進行方差分析，顯著性檢驗方法為鄧肯多重檢驗，檢測限為0.05［13］。有關數據為3次以上平均值。

表1 感官評價標準Table 1 Standards of sensory evaluation

2 結果與分析

2.1 恒溫發酵對加曲發酵魚露性質的影響

2.1.1 醬醅的pH 圖1顯示了不同溫度下魚露醬醅pH的變化。由圖可見，醬醅pH都呈現出先下降后上升的趨勢，提高發酵溫度，前期的pH下降速度明顯加快，這可能是提高溫度促進了乳酸菌發酵產酸的緣故。20℃和40℃保溫發酵在發酵60d后，醬醅pH都逐漸趨于穩定，而且在20℃保溫發酵的pH最低;30℃保溫發酵的醬醅pH在60d后出現上升的趨勢，經過90d發酵后其pH逐漸接近6.0。pH是魚露發酵過程中各種反應的綜合表現。通常，伴隨著發酵的進行，魚肉中有機酸類物質的溶出以及蛋白質水解為游離氨基酸等會使醬醅pH下降，而在腐敗微生物的作用下，含氮化合物等分解產生組胺、三甲胺等堿性物質將使醬醅pH上升［14］。甚至有研究指出，當腐敗菌生長旺盛時，醬醅pH就會迅速上升并超過6［15］。因此，圖1的結果表明加曲速釀魚露的發酵不適合在30℃下進行。

圖1 不同發酵溫度下魚露醬醅pH的變化Fig.1 The pH changes of fish sauce mash during fermentation with different temperature

2.1.2 氨基酸態氮(AA－N) 氨基酸是魚露的主要呈味物質，也是用來判定魚露發酵程度的特性指標［16］。因此，對發酵過程中魚露的氨基酸態氮(AA－N)含量變化進行了測定，結果如表2所示。從表中可以看出，不管在任何發酵溫度下，伴隨著發酵時間的延長，魚露中AA－N含量均出現逐漸增加的趨勢，經過70d發酵后開始出現穩定;20℃下發酵的魚露AA－N含量最低，30℃和40℃發酵獲得的魚露AA－N含量基本相同。魚露中的氨基酸主要是魚肉蛋白在各種蛋白酶和微生物作用下分解產生的，而蛋白酶和微生物的活性主要受到pH和溫度的影響，發酵溫度太低時有些蛋白酶和微生物的活性也較低，然而過高的發酵溫度可能使有些蛋白酶或微生物失去活性。因此，表2的結果表明適當提高發酵溫度可以促進蛋白質分解成氨基酸。

表2 發酵溫度對魚露氨基酸態氮含量(AA－N，g/100mL)的影響Table 2 Effect of fermentation temperature on the amino－acid nitrogen content(AA－N，g/100mL)of fish sauces

2.1.3 可溶性總氮(TS－N) 可溶性總氮(TS－N)含量是魚露質量分級的重要指標之一，是魚露中游離氨基酸態氮、小分子肽氮、可溶性蛋白氮等物質的綜合反映［17］。在發酵過程中溫度對魚露中TS－N含量的影響如表3所示。由表可知，不管是低溫發酵還是高溫發酵，發酵70d以后魚露中的TS－N含量基本趨于穩定。而且，發酵溫度越高，魚露中TS－N含量也越多，進一步表明了提高發酵溫度有利于魚肉蛋白的分解和可溶性蛋白的溶出。

根據以上的分析結果，發現20℃低溫發酵雖然可以使醬醅pH保持穩定，然而魚露中的AA－N和TS－N含量都比較低。另一方面，提高發酵溫度雖然可以提高魚露中的AA－N和TS－N含量，然而也可能會促進醬醅中腐敗微生物的生長繁殖，導致醬醅pH上升。因此，采用先低溫后高溫分段保溫發酵方式進一步探討溫度對加曲速釀魚露性質的影響。

表3 發酵溫度對魚露可溶性總氮含量(TS－N，g/100mL)的影響Table 3 Effect of fermentation temperature on the total soluble nitrogen content(TS－N，g/100mL)of fish sauces

2.2 分段保溫發酵對魚露性質的影響

2.2.1 醬醅的pH 圖2顯示了先低溫后高溫分段保溫發酵對醬醅pH的影響。從圖中可以看出，將20℃發酵30d的醬醅移到30℃下繼續發酵60d(20～30℃)，發酵后期pH雖然也出現緩慢上升趨勢，但與單一的30℃恒溫發酵相比(圖1)，醬醅pH的上升的速度明顯得到抑制。另一方面，對20℃發酵30d，接著30℃發酵30d，最后40℃發酵30d(20－30－40℃)的醬醅pH進行分析，結果發現pH在發酵過程中沒有出現上升的趨勢。通常，低溫發酵有助于抑制腐敗菌的生長繁殖，同時魚肉蛋白分解生成游離氨基酸，促使醬醅呈現酸性，也會抑制腐敗微生物的作用。因此，先低溫后高溫分段保溫發酵工藝可以抑制加曲速釀低鹽魚露在發酵過程中pH的上升，達到抑制腐敗菌生長繁殖的作用。

圖2 分段發酵下魚露醬醅pH的變化Fig.2 The pH changes of fish sauce mash during subsection fermentation

2.2.2 氨基酸態氮(AA－N) 表4顯示了分段保溫發酵對魚露AA－N含量的影響。將20℃發酵30d的醬醅移到30℃下進行發酵時，魚露中的AA－N含量出現明顯的增加，而且在30℃下繼續發酵40d后，發酵總天數達到70d時，AA－N含量逐漸穩定在1.29g/100mL，但略低于 30℃恒溫發酵的 1.36g/100mL(表2)。這可能是30℃恒溫發酵時腐敗微生物繁殖旺盛，魚露中銨鹽含量增加，結果導致利用甲醛滴定法測定的氨基酸態氮數據偏高［18］。另一方面，當利用20－30－40℃分段保溫發酵制備魚露時，發酵90d的魚露AA－N含量與40℃恒溫發酵(1.35g/100mL)基本一致，表明通過分段保溫發酵不會影響魚露產品的AA－N含量。

表4 分段發酵對魚露氨基酸態氮含量(AA－N，g/100mL)的影響Table 4 Effect of subsection fermentation process on amino－acid nitrogen content(AA－N，g/100mL)of fish sauces

2.2.3 可溶性總氮(TS－N) 表5顯示了在發酵過程中不同分段發酵對魚露TS－N含量變化的影響。與AA－N含量變化趨勢類似(表4)，在改變發酵溫度后，魚露TS－N含量都出現明顯的增加，20－30－40℃發酵下的魚露可以獲得高含量的TS－N，進一步表明了采用逐漸升溫的分段發酵方式可以有效實現魚肉蛋白的分解以及可溶性蛋白的溶出，縮短魚露發酵時間。

表6 魚露中揮發性鹽基氮含量(TVB－N)Table 6 The total volatile basic nitrogen(TVB－N)of fish sauces

表5 分段發酵對魚露可溶性總氮含量(TS－N，g/100mL)的影響Table 5 Effect of subsection fermentation process on total soluble nitrogen content(TS－N，g/100mL)of fish sauces

2.3 魚露品質的分析

2.3.1 揮發性鹽基氮(TVB－N) 為了進一步了解發酵溫度和發酵方式對魚露品質的影響，對發酵90d的魚露產品的揮發性鹽基氮(TVB－N)進行了測定，結果如表6所示。在恒溫發酵下，20℃和40℃下發酵獲得的魚露TVB－N含量都較低，而30℃發酵魚露的TVB－N含量最高。另一方面，利用20－30℃方式發酵得到的魚露其TVB－N含量明顯比30℃恒溫發酵的魚露少，而且利用20－30－40℃逐級升溫發酵方式獲得的魚露TVB－N含量最低。通常，TVB－N是指魚露中蛋白質、小分子肽、氨基酸等在微生物的作用下分解形成氨、三甲胺等堿性含氮化合物，是用來衡量魚露腐敗變質的一個重要指標［19］。因此，加曲速釀魚露在30℃發酵時，可能由于腐敗微生物容易繁殖，結果導致魚露產品TVB－N含量增加。然而，利用先低溫后高溫分段保溫發酵方式可以減少魚露產品TVB－N含量，表明這種發酵方式可以抑制發酵過程中腐敗微生物的生長繁殖。

2.3.2 游離氨基酸組成的分析 據報道，谷氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等游離氨基酸(FAA)是魚露的主要呈味氨基酸［20］。因此，以特級商品魚露為對照，對不同發酵方式獲得的魚露的FAA組成進行測定，并對魚露呈味氨基酸進行歸類分析［20－21］，結果如表7所示。由表可知，100mL商品魚露中含有8.4g左右的FAA，鮮味氨基酸和甜味氨基酸占總的FAA比例分別達到37.1%和42.2%，尤其谷氨酸和甘氨酸的比例分別高達33.7%和27.5%，這可能是商品魚露被勾兌的緣故。利用恒溫發酵方式經過90d發酵制備低鹽魚露時，隨著發酵溫度的升高，魚露中FAA總量和苦味氨基酸的比例都出現上升的趨勢，但鮮味氨基酸比例卻出現下降。當采用分段發酵方式經過90d發酵制備低鹽魚露時，魚露中FAA總量增加，而苦味氨基酸的增加趨勢明顯得到抑制，表明該發酵工藝有利于改善加曲低鹽速釀魚露的品質。

2.3.3 魚露的感官評價 表8顯示了經過90d發酵制備的各種魚露的感官評價結果。在氣味方面，商品魚露除了具有較高的醬香味和肉香味以外，還具有較強的魚腥味。恒溫發酵獲得的魚露尤其是在30℃下發酵時魚腥味最強，接近商品魚露，但隨著發酵溫度的升高或下降，魚露的魚腥味都出現減弱現象。而且當采用分段發酵方式時，魚露的魚腥味進一步減弱。通常，魚腥味主要是氧化三甲胺在酶和微生物作用下生成三甲胺引起的。30℃發酵下可能由于腐敗微生物繁殖比較快，導致產品的魚腥味偏高。另一方面，提高發酵溫度將促進醬醅中氨基酸和糖發生美拉德反應，反應生成物可能遮蓋部分的魚腥味，使40℃恒溫發酵和20－30－40℃分段發酵得到的魚露中魚腥味減弱。胺味是魚露的另一項不良氣味，感官評價結果表明，發酵溫度對魚露胺味的影響趨勢與魚腥味類似。此外，加曲發酵魚露的醬香味、肉香味分值與商品魚露接近，而且溫度和發酵方式對其沒有產生明顯的影響。

在滋味上，由于曲中乳酸菌繁殖旺盛的緣故，結果導致加曲發酵魚露產品的酸味分值比商品魚露高，但利用分段發酵方式可以得到明顯的改善。采用40℃發酵后魚露中出現一定程度的苦味，這可能是該發酵溫度下魚露中產生的苦味氨基酸比例偏高的緣故(表7)。此外，溫度和發酵方式對魚露的鮮味沒有產生明顯的影響。因此今后將繼續優化先低溫后高溫分段發酵工藝，減少40℃發酵時間，進一步縮短低鹽魚露的生產周期。本研究制備的魚露鹽分含量為11.7%～12.6%，遠低于商品魚露的28.2%，如果適當提高魚露的鹽分含量可能還會增強產品鮮味。

由于傳統魚露生產周期長，因此國內外許多學者對速釀工藝已經開展了大量的研究，其中外加酶發酵工藝生產周期最短，有的發酵周期僅為15d左右［22］，但制備的魚露風味物質含量低，感官質量不如傳統發酵魚露。當利用蛋白酶結合生物發酵劑速釀魚露時，發酵時間需要120d左右［23］。因此，綜合考慮發酵時間和魚露品質，采用本研究的控溫加曲速釀工藝生產低鹽魚露將具有更大的優勢。

3 結論

3.1 恒溫發酵下，提高發酵溫度可以促進魚肉蛋白的分解和溶出，有助于提高魚露中的 AA－N、TS－N含量。然而30℃恒溫發酵可能會促進腐敗微生物的生長繁殖，導致發酵后期醬醅的pH迅速上升，魚露中TVB－N含量偏高。過高的發酵溫度(40℃)會使魚露中的鮮味氨基酸和甜味氨基酸比例下降，苦味氨基酸比例升高，表現為感官分析時可以感覺到苦味。

表7 魚露中游離氨基酸的組成(FAA，g/100mL)Table 7 Free amino acid compositions(FAA，g/100mL)of fish sauces

表8 魚露的感官評價Table 8 Sensory evaluation of fish sauces

3.2 采用先低溫后高溫分段發酵，魚露中的各種理化指標都可以得到改善，感官評價也獲得好評。因此，本研究結果表明，采用先低溫后高溫分段發酵方式將促進加曲速釀低鹽魚露的生產工藝投入實際應用。

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