用螠蟶貝殼制備乳酸菌富集鈣的工藝

張付云，李云冰，楊晴宇，李妍，王斌，楊陽，蒼桂璐

（大連海洋大學食品工程學院，遼寧 大連 116023）

用螠蟶貝殼制備乳酸菌富集鈣的工藝

張付云，李云冰，楊晴宇，李妍，王斌，楊陽，蒼桂璐

（大連海洋大學食品工程學院，遼寧 大連 116023）

為了充分利用螠蟶貝殼資源開發新型生態補鈣制劑，用兩種乳酸菌發酵螠蟶貝殼粉，以發酵結束后乳酸菌的活菌數和游離鈣轉化率為指標，優選出最佳發酵工藝。研究結果表明，最佳發酵條件為300目粒度的螠蟶貝殼粉15%，蔗糖8%，1:1混合的保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌接種量7%，發酵30 h。

螠蟶貝殼粉；保加利亞桿菌；嗜熱鏈球菌；離子鈣

人體是一個有機的生命體，在所有的生命活動過程中，需要有各種物質的參與，這些元素除碳、氫、氧以有機物的形式存在外，其余的統稱礦物質。身體的鈣大多分布在骨骼和牙齒中，約占總量的99%，其余1%分布在血液、細胞間液及軟組織中，這部分鈣統稱為混溶鈣池，它在維持正常生理活動中，起著重要作用[1]。鈣參與神經肌肉的應激過程，調節細胞內的各種功能，促進腺體和神經介質的分泌；促進糖原合成、分解及電解質的轉運；參與血液的凝固；參與維持細胞膜的通透性及完整性；參與人體免疫反應，加快吞噬細胞的吞噬過程，增加人體的免疫力[2]。如果人體長期鈣攝入不足，就可能導致骨質疏松、骨質增生、兒童佝僂病、手足抽搐癥以及高血壓、腎結石、結腸癌、老年癡呆等疾病的發生[3]。由此可見補充鈣質增強骨骼健康非常重要，而補充鈣制劑是人們補鈣的首選。

目前市場上的鈣制劑根據原料來源分為三類：一類是無機鈣，又稱為第一代補鈣產品如碳酸鈣、磷酸鈣及氧化鈣，這種鈣劑往往含鈣量低且難于吸收，有的因為水溶性較差，長期服用會引起大便干燥、食欲不振、胃疼等。第二類是有機酸鈣，即第二代鈣劑如葡萄酸鈣、檸檬酸鈣、醋酸鈣等，這種鈣劑產品往往存在著含鈣量低和生物利用度不高的缺陷[4]。第三類是有機鈣，即第三代鈣劑如絡合鈣，目前研究較少，價格相對來說較貴。醫學界認為好的鈣吸收和利用與攝入鈣形態，以及適宜的鈣磷比和氨基酸的存在有密切的關系[5]。

螠蟶是一種大眾化的海產品，我國沿海每年都會有數十萬噸的螠蟶需要加工，大量的螠蟶貝殼不能充分利用，造成環境污染和資源浪費。而螠蟶貝殼碳酸鈣含量非常高[6]。若利用腸道乳酸菌發酵天然富含鈣質的螠蟶貝殼粉，由于乳酸菌代謝產生的酸使結合態的鈣轉變成游離的鈣離子，使無機鈣轉變成為有機鈣有利于人體對鈣的吸收。另乳酸菌是腸道有益菌，若將螠蟶貝殼粉經發酵加工成含有菌體的補鈣制品，也可改善腸道的消化吸收功能[7]。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

新鮮螠蟶購于大商新瑪特黑石礁店；乳酸菌發酵劑購于北京川秀科技有限公司；檸檬酸氫二銨，葡萄糖，吐溫80，乙酸鈉，氫氧化鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，蔗糖，鈣指示劑均為國產分析純；瓊脂粉（津Q/HB3554），蛋白胨（符合中國生物制品主要原輔料質控標準），牛肉膏（QB/ABX01-009-2005）。

1.2 儀器與設備

電子天平（BS224S）：北京賽多利斯天平有限公司；離心機（LD5-2A）：北京醫用離心機廠；電熱恒溫培養箱（HH.BII.420-BS）、超凈工作臺（S.HS-1300）：上海躍進醫療器械廠；測速氣浴振蕩器（SHZ-82A）：蘇州威爾實驗用品有限公司；低速臺式離心機（90-2）：上海醫療器械有限公司；手提式不銹鋼蒸汽消毒器（YX280B）：上海三申醫療器械有限公司；高速萬能粉碎機（FW-100）：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 實驗方案

2.1 主要工藝流程

2.2 操作要點

2.2.1 螠蟶貝殼前處理

選市售優質螠蟶，將其貝殼蒸煮去雜清洗風干，用萬能粉碎機粉碎后，分別用60目、100目、300目的篩子，篩選出粒度為60目、100目和300目的貝殼粉密封保存備用。

2.2.2 菌種活化

將純化的嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌分別接種于脫脂乳培養基[8]中，40℃培養24 h。

2.2.3 發酵螠蟶貝殼粉的乳酸菌菌種選擇

將活化的乳酸菌按保加利亞桿菌（Ⅰ）、嗜熱鏈球菌（Ⅱ）、保加利亞桿菌:嗜熱鏈球菌=1:1（Ⅲ）、以 3%的接種量在無菌條件下接種于滅菌的種子液（100目螠蟶貝殼粉15%，蔗糖5%，脫脂乳10%，蒸餾水70%）中，置于38℃～39℃的恒溫培養箱中培養24 h。將培養好的3種種子液以3%的接種量在無菌條件下接種于無菌發酵培養基（100目螠蟶貝殼粉10%，蔗糖5%，蒸餾水85%）中，于44℃間歇振蕩培養發酵24 h，依次進行活菌數，離子鈣含量測定。

2.2.4 螠蟶貝殼粉最佳發酵時間的確定

按2.2.3方法制備保加利亞桿菌:嗜熱鏈球菌體積比為1:1的乳酸菌種子液，將培養好的種子液以3%的接種量在無菌條件下接種于發酵培養基中（配方同2.2.3），于 44℃間歇振蕩培養發酵，分別于 24、30、36 h，依次進行活菌數，離子鈣含量測定。

2.2.5 正交試驗優化螠蟶貝殼粉發酵條件

按2.2.4方法制備種子液，在無菌條件下按正交試驗方案（表1）接種于發酵培養基中，于44℃間歇振蕩培養發酵30 h，依次進行活菌數，離子鈣含量測定。

由于螠蟶貝殼粉粒度（A），乳酸菌接種量（B），蔗糖濃度（C），螠蟶貝殼粉濃度（D）是直接影響發酵效果的重要因素，故將其作為本試驗的正交因素，并選取3個水平，設計L9（34）的試驗方案，見表1。

表1 發酵正交試驗因素水平Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment for fermentation

2.2.6 活菌數的測定[8]

在無菌條件下取1mL充分混勻的發酵液制備10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列稀釋樣液，分別取 0.1 mL 稀釋樣液均勻涂布于MRS培養基表面，每個樣品做3個重復，靜置使菌液滲入培養基內，于40℃恒溫培養48 h計數。按下列公式計算每毫升樣品中的活菌數：

每毫升樣品中菌落形成單位（cfu）＝同一稀釋度的平均菌落數×稀釋倍數×10

2.2.7 螠蟶殼總鈣量的測定

稱取1g的100目螠蟶貝殼粉于小燒杯中，加入1mL蒸餾水潤濕，再從燒杯邊緣逐滴加入鹽酸溶液至粉末完全溶解，然后加熱近沸，充分攪拌。溶液3000 r/min離心5 min除去大顆粒沉淀，上清液5000 r/min離心15 min，測定上清液中離子鈣的量，即為1 g螠蟶貝殼粉中的總鈣量。

2.2.8 離子鈣含量的測定[9]

移取2 mL發酵物離心（3000 r/min,5 min）除去大顆粒沉淀，上清液離心（5000 r/min,15 min）除去大量菌體，上清液用于測定Ca2+的含量，每個樣品重復測定3次。

準確吸取1mL樣品，2mL100g/L的NaOH和10mg的鈣指示劑于錐形瓶中，用已標定的0.01 mol/L的EDTA溶液滴定，不斷搖動錐形瓶，當溶液變為純藍色時，記下滴定液的體積V。

鈣轉化率/%=發酵液離子鈣量/螠蟶殼總鈣量×100

3 結果與分析

3.1 發酵螠蟶貝殼粉的乳酸菌菌種選擇結果

以3種組合方式接種乳酸菌發酵結果檢測如表2。

表2 3種菌發酵螠蟶貝殼粉結果Table 2 The results for shell powder of Sinonovacula constricta fermented by 3 kinds lactobacillus

測定結果表明第3種方式即保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌=1:1的發酵效果好于保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌單獨發酵的效果，其發酵產物的活菌數和鈣離子轉化率均高于前兩組，因此確定用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以1:1的比例混合發酵螠蟶貝殼粉，以獲得含較多離子鈣和乳酸菌活菌的補鈣制劑。

3.2 螠蟶貝殼粉最佳發酵時間優化結果

在發酵液組成和培養溫度相同的條件下，發酵不同時間的發酵效果如表3。

表3 螠蟶貝殼粉發酵不同時間的結果Table 3 The results for shell powder of Sinonovacula constricta fermented by diferent time

檢測結果表明培養30 h的發酵液的鈣離子轉化率高達21.85%，活菌數也明顯多于24 h和36 h，可見時間過長或過短都會影響發酵結果。發酵時間過短，活的乳酸菌數量較少，鈣離子得不到充分的轉化；發酵時間過長，乳酸菌進入生長曲線的衰亡期出現負生長，因此發酵液中活菌數目減少，鈣離子轉化率降低可能是由于發酵后期乳酸菌的一些代謝產物絡合了部分離子鈣的結果。因此選擇30 h作為乳酸菌發酵螠蟶貝殼粉的時間，以獲得高質量的補鈣制品。

3.3 螠蟶貝殼發酵條件正交試驗優化結果

螠蟶貝殼發酵條件正交試驗優化結果見表4。

表4 發酵條件正交試驗優化結果Table 4 Results of orthogonal experiment for fermentation

從正交試驗數據和處理結果表中的極差（R）表明，對鈣離子轉化率影響最大的是螠蟶貝殼粉粒度（A）和乳酸菌接種量（B），其次是發酵液中螠蟶貝殼粉濃度（D）、蔗糖濃度（C），最佳發酵組合為 A3B3D1C2，即螠蟶貝殼粉粒度為300目、乳酸菌接種量為7%、發酵液中螠蟶貝殼粉濃度為15%、蔗糖濃度為8%。這是由于螠蟶貝殼粉顆粒越小，在發酵液中分散度越高，與乳酸菌生長代謝產生的乳酸接觸越充分，結合態鈣被轉化成離子鈣的效率越高；乳酸菌接種量高，發酵結束時活的乳酸菌數較多，代謝產生乳酸總量也較多，可使較多的結合鈣被轉化成離子鈣；螠蟶貝殼粉在15%和蔗糖濃度為8%時，更有利于乳酸菌生長繁殖，發酵結束時活菌數較多，乳酸產生量也較高，因此形成的離子鈣也較多，相應的鈣離子轉化率也高，當螠蟶貝殼粉濃度較高時，不利于乳酸菌生長，因此活菌數較少且貝殼粉中的結合鈣也不能被充分的轉化成離子鈣。

4 結論

1）本研究探索了一種用螠蟶貝殼制備乳酸菌富集鈣的工藝，螠蟶經去肉、清洗、風干、粉碎、滅菌、接菌和發酵等工藝制得含活性乳酸菌的生態補鈣制品。

2）以發酵結束時，發酵產品中活的乳酸菌數和鈣轉化率為檢測指標優化出發酵工藝條件為：用1:1的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發酵菌種，在粒度為300目的螠蟶貝殼粉、乳酸菌接種量7%、發酵液中螠蟶貝殼粉濃度15%和蔗糖濃度為8%的條件下發酵30 h。

[1]吳嘉惠.鈣的生理作用及其與其它元素的關系[J].中國實用兒科雜志,1999,14(10):584

[2]錢之玉.藥理學進展[M].南京:東南大學出版社,2005:367

[3]李笑萍.臨床使用鈣制劑的藥學問題點[J].中國藥師,2000,3(4):238-239

[4]趙淑霞.鈣的吸收及其影響因素[J].中國實用兒科雜志,2005,14(10):580

[5]俞淑敏,沈時霖.鈣磷代謝的調節[J].中國實用兒科雜志,1999,14(10):583-584

[6]馬賢才.鈣劑的合理應用[J].中國實用兒科雜志,2006,14(10):560

[7]郭海嬰.老年人胃腸疲憊益生菌迅速補養[J].長壽,2009(3):34-35

[8]李平蘭,賀稚非.食品微生物學實驗原理與技術[M].北京:中國農業出版社,2005:129-133,223-225

[9]雷衍之.化學實驗[M].北京:中國農業出版社,2004:52-53

Preparation of Lactobacillus Enriching Calcium from Shell Powder of Sinonovacula constricta

ZHANG Fu-yun,LI Yun-bing,YANG Qing-yu,LI Yan,WANG Bin,YANG Yang,CANG Gui-lu
（College of Food Engineering,Dalian Ocean University，Dalian 116023,Liaoning,China）

To developing new biological calcium product,two kinds of lactobacillus were used for ferment the shell powder of Sinonovacula constricta.The ferment conditions were defined through comparing the total number of live lactobacilli and the conversion of ionic calcium.Research results suggest that the optimal conditions were adding 15%shell powder of 300 mesh,8%sugar and 7%admixture of lactobacillus bulgaricus and streptococcus thermophilus,fermentation for 30 h.

shell powder of Sinonovacula constricta;lactobacillus bulgaricus;streptococcus thermophilus;ionic Ca

遼寧省教育廳科學技術研究項目（2009A164）；大連市科學技術基金（2010J21DW017）

張付云（1969—），女（漢），副教授，博士，研究方向：海洋資源綜合利用。

2011-12-06