6種食用菌菌絲體多糖含量的比較

熊芳，孫淑靜，肖穎，胡開輝

（福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

6種食用菌菌絲體多糖含量的比較

熊芳，孫淑靜，肖穎，胡開輝*

（福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

以熱水浸提的方法分別從香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝的菌絲體中提取多糖，并用苯酚-硫酸法對多糖含量進行測定。結果表明,這6種食用菌菌絲體的多糖含量分別為，4.84%、3.45%、7.72%、3.14%、11.18%和5.22%。同時通過對羥自由基清除能力的測定對這6種多糖進行抗氧化活性研究，結果表明,雖然茶樹菇多糖含量最高，但其清除羥自由基的能力最弱；鳳尾菇和秀珍菇的多糖含量相對較低，但羥自由基的清除率較高；而金針菇、赤芝和香菇不僅多糖含量較高，而且對羥自由基的清除能力也較好。相比較而言，金針菇多糖具有更廣闊的開發利用前景。

食用菌；菌絲體；多糖；抗氧化；羥自由基

香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝這6種食用菌作為我國食（藥）用菌的主栽品種，不僅味道鮮美、營養豐富，還含有多種生物活性物質，如維生素、多肽、菌多糖等。多糖是一類具有高活性的生命大分子物質，它在抗腫瘤、抗凝血、刺激免疫以及降血糖、清除自由基和抗氧化方面具有一定的作用[1]。研究結果表明，食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的作用，從而起到保護生物膜和延緩衰老的作用[2]。

20世紀90年代至今，國內外對香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝的子實體多糖的研究較多，但幾乎沒有對于菌絲體多糖的研究報道。從菌絲體中提取的多糖具有安全、低毒、來源廣泛等特點，可代替傳統抗氧化劑，具有廣闊的發展前景。本實驗通過對6種食用菌菌絲體多糖含量的測定及其對羥自由基的清除能力的測定，比較他們多糖含量和羥自由基清除能力的大小，以找出多糖含量較高且對羥自由基清除能力較好的菌種，旨在為相關生產企業選擇多糖原材料及其開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

香菇、鳳尾菇、金針菇、秀珍菇、茶樹菇、赤芝菌株均為福建農林大學微生物工程實驗室保藏菌種。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、牛血清蛋白、雙氧水、水楊酸、七水合硫酸亞鐵。以上試劑均為進口或國產分析純。

電子天平（BSA124S）：北京賽多利斯；（恒溫）搖床（SKY-200B）：上海蘇坤；恒溫培養箱（DNP-9162）：上海精宏；立式高壓滅菌鍋（LX-B75L）：合肥華泰醫療設備有限公司；VIS-7220可見分光光度計：北京瑞利；等。

1.3 實驗培養基

馬鈴薯（PDA）培養基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 20 g（液體培養基不需），水 1000 mL，pH 自然，121℃，濕熱滅菌30 min備用。

1.4 菌絲體培養方法

1）將菌種接于PDA斜面培養基上，20℃恒溫培養箱培養7 d左右，進行擴大培養。

2）將配好的培養基以100 mL/瓶分裝于250 mL三角瓶中，121℃濕熱滅菌30 min，用于接種。

3）采用無菌操作，從斜面上取大小相近的約0.5cm2的母種塊，接種于PDA液體培養基（菌塊要薄，盡量使菌塊漂浮在液面上），每瓶接種3塊～5塊。20℃～25℃靜置24 h，然后置于20℃～25℃、130 r/min左右的搖床中培養，培養時間因菌類不同而異，一般是10 d左右。

1.5 菌絲體多糖的提取方法[3-4]

熱水浸提和乙醇醇析法。

1.6 菌絲體多糖含量的測定[3-8]

1.6.1 葡萄糖標準曲線的制備

1）葡萄糖標準液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品1 g，溶解稀釋后定容有于100 mL容量瓶中，配成10 mg/mL的標準貯備液，精密吸取貯備液1 mL定容至100 mL，配成0.1 mg/mL的葡萄糖標準液。

2）葡萄糖標準曲線的制定：精密移取葡萄糖標準液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光值。

1.6.2 樣品溶液的制備

精密稱取菌絲體粗多糖粉末20 mg，加蒸餾水溶解并定容至250 mL，搖勻，即為待測樣液。

1.6.3 精密度試驗

取菌絲體多糖樣品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度,平行測定5次。

1.6.4 穩定性試驗

取菌絲體多糖樣品液各2.0 mL，加6%苯酚溶液1.5mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，振搖，放置10min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，測定其吸光值在時間 20、30、40、50、60 min 后的變化。

1.6.5 加樣回收率試驗

采用加樣回收法測定回收率。取菌絲體多糖樣品液各1.0 mL，分別加入標準葡萄糖溶液0.1 mL，后用蒸餾水補充至2.0 mL，另以1 mL樣品溶液加1 mL蒸餾水為樣品含量測定，然后分別加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度,根據葡萄糖的檢出量，計算其回收率：

回收率/%=（實驗測值-樣品所含被測成分量）/加入純品量×100

1.6.6 換算因子的確定

精密吸取該樣品液1.0 mL，蒸餾水補充至2.0 mL，再各加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度。并根據標準曲線的回歸方程計算出供試液中的葡萄糖含量，按下式計算換算因子：

換算因子f=m/（C×D×V）

式中：m為稱取的多糖質量,mg；C為多糖溶液中葡萄糖的質量濃度，（mg/mL）；D為多糖的稀釋倍數；V為體積，mL。

1.6.7 多糖含量的測定

精密稱取適量干燥后香菇、鳳尾菇、秀珍菇、赤芝的菌絲體樣品1 g以及金針菇、茶樹菇樣品0.5 g，分別置于具塞三角瓶中，按一定料液比、浸提溫度、浸提時間，在熱水浴中浸提5 h，用布氏漏斗抽濾后加2倍體積無水乙醇溶液，靜置24 h后，離心，沉淀用蒸餾水溶解，定容至250 mL，即為待測樣液。

精密吸取樣品液1.0 mL，于具塞刻度試管中，加蒸餾水至2 mL，各加6%苯酚溶液1.5 mL并搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，放置10 min，置沸水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫，于490 nm，以試劑空白為參比測定吸光度，平行測定3次。根據標準曲線的回歸方程計算出多糖溶液中葡萄糖的質量分數C，并按下式計算樣品中多糖的質量分數：

多糖含量=（C×D×V×f）/W×100%

式中：W為稱取子實體或菌絲體的樣品質量，mg；f為換算因子；C為多糖液中葡萄糖的含量，（mg/mL）；D為多糖的稀釋倍數；V為體積，mL。

1.7 多糖對羥自由基清除能力的測定[9-12]

1.7.1 樣品溶液的制備

精密稱取一定質量的菌絲體粗多糖粉末，加蒸餾水溶解，使其配制成一定濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的待測樣液。

1.7.2 多糖對羥自由基清除能力的測定

精密吸取4.5 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，相應濃度的待測溶液1 mL，于試管中，最后加入4.4 mmol/L H2O21 mL以啟動整個反應。37℃反應0.5 h后，12000 r/min離心6 min，然后以蒸餾水作參比，在510 nm下測定吸光度。考慮待測溶液本身的吸光值不同，以待測溶液1 mL，4.5 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL和蒸餾水1 mL作為待測溶液的本底吸收值。清除率計算公式為:

清除率＝[A0－（AX－AX0）]/A0×100%

式中：A0為空白對照液的吸光度；AX為待測溶液后的吸光度；AX0為待測溶液的本底吸收值。每一吸光值平行測3次，取其平均值，結果用X±SD表示，并采用t檢驗法。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定結果

2.1.1 葡萄糖標準曲線的建立

葡萄糖標準溶液的濃度及相應吸光值見表1，葡萄糖標準曲線見圖1。

表1 葡萄糖標準溶液的濃度及相應吸光值Table 1 Consistence and OD of the glucose standard solution

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可看出，葡萄糖標準曲線的相關系數R2=0.9991，表明質量濃度在0.01 mg/mL～0.07 mg/mL時，葡萄糖的質量濃度與吸光值之間呈現出良好的線性關系，很好地符合了郎伯—比爾定律。

2.1.2 精密度實驗結果

精密度實驗結果見表2。

表2 菌絲體多糖精密度實驗Table 2 The experiment to calculate the precision of mcelia polysaccharide

由表2可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖樣品溶液5次平行測定的相對標準偏差 RSD 為 0.85%、0.77%、0.92%、0.63%、0.82%和0.74%（n＝5），均小于1%，表明實驗的精密度較好。

2.1.3 穩定性試驗結果

穩定性試驗結果見表3。

表3 菌絲體多糖穩定性實驗Table 3 The experiment to calculate the stability of mcelia polysaccharide

由表3可知，香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖溶液的吸光值在顯色后的20 min～60 min內變化不大，說明了在此段時間范圍內的穩定性良好。

2.1.4 回收率試驗結果

回收率試驗結果見表4。

表4 菌絲體多糖溶液回收率實驗Table 4 The experiment to calculate the recovery of mcelia polysaccharide

由表4可知，5次平行測定RSD均小于1%（n＝5），又根據1.6.5中公式，求得香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖樣品溶液回收率分別為99.4%、100.9%、101.6%、108.1%、109.6%和102.3%，六者回收率均在99%～110%之間，表明本實驗的測定方法是可靠、可行的。

2.1.5 多糖含量的測定結果

按照1.6.7所述方法，平行測定3次香菇、秀珍菇、赤芝、金針菇、鳳尾菇、茶樹菇菌絲體多糖提取液的吸光值如表5。可知，菌絲體多糖的含量茶樹菇＞金針菇＞赤芝＞香菇＞鳳尾菇＞秀珍菇。

2.2 多糖對羥自由基清除能力的測定結果

多糖對羥自由基清除能力的測定結果見表6。

表5 菌絲體多糖樣品溶液的吸光值Table 5 The OD of polysaccharides sample solution from the mycelium

由試驗結果可知，6種食用菌菌絲體多糖對羥自由基清除能力都比較好（在多糖濃度為5 mg/mL時，最大清除率在64%～84%之間），且在一定濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）范圍內六種食用菌菌絲體多糖對羥自由基清除能力隨著多糖濃度的增大而增大。

表6 多糖對羥自由基的清除能力Table 6 The Hydroxyl radical scavenging of polysaccharides in mycelium

3 結論與討論

自由基在化學結構上是指含有未配對電子的基團、分子或原子，包括超氧陰離子、羥自由基（·OH）、脂質過氧化物（LPO）等。它是人體內的正常代謝產物。在正常情況下,人體內的自由基處于動態平衡中，但是一旦該平衡被打破,就會對機體造成損害，從而引發一系列相關疾病[13]。研究發現，許多天然食品（柴胡[14]、馬齒莧[15]、山藥[16]等）中的多糖都具有清除自由基、抗氧化的能力，而食用菌多糖由于其毒副作用小、安全性強，與動物和植物多糖相比具有產量和質量不受自然條件影響的特點，被越來越多的人所關注。

本試驗通過熱水浸提以及芬頓（Fenton）反應法從6種食用菌的菌絲體中提取多糖并測定其抗氧化活性。結果表明，雖然茶樹菇多糖含量最高（11.18%），但其清除羥自由基的能力最弱（在多糖濃度為5 mg/mL時，最大清除率在65%）；鳳尾菇和秀珍菇雖清除率較高（在多糖濃度為5 mg/mL時，最大清除率分別為80%和71%），但他們多糖含量較低（分別為3.45%和3.14%）；而金針菇、赤芝和香菇不僅多糖含量較高（依次為7.72%、5.22%和4.84%），而且對羥自由基的清除能力（在多糖濃度為5 mg/mL時，最大清除率依次為82%、84%和75%）也較好，其中以金針菇的多糖含量和清除能力的比例最好，這為下一步對金針菇的綜合開發利用提供參考依據。

[1]黨蕾,郝佳欣,江海濤.幾種食用菌多糖抗氧化活性比較[J].安徽農學通報,2010,16(5):76-77

[2]方積年,丁侃.天然藥物一多糖的主要生物活性及分離純化方法[J].中國藥學雜志,2007,26(9):338-345

[3]王建壯,安潔呂,華沖.植物多糖含量測定的方法研究[J].海峽藥學,2008,20(5):48-50

[4]于村,丁鋼強,俞莎,等.香菇多糖測定方法學研究[J].中國公共衛生雜志,2000,16(3):245

[5]鐘巖,潘浦群,王艷紅,等.苯酚-硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫國藥,2008,19(8):1957-1958

[6]王文平,郭祀遠,李琳,等.苯酚-硫酸法測定野木瓜中多糖含量的研究[J].食品科學,2007,28(4):276-278

[7]鄭必勝,唐芳勇,閆文娟,等.苯酚-硫酸法測定廣東蟲草菌絲體多糖含量的研究[J].農產品加工學刊,2008(8):17-21

[8]李研,魏建和,許旭東,等.苯酚-硫酸法測定桔梗多糖含量的研究[J].時珍國醫國藥,2009,20(1):5-7

[9]傅博強,謝明勇,聶少平,等.茶葉中多糖含量的測定[J].食品科學,2001,22(11):69-72

[10]張俊會,王謙.杏鮑菇多糖的抗氧化活性研究[J].中國食用菌,2003,3(2):38-39

[11]游育紅,林志彬.靈芝多糖肽的抗氧化作用[J].藥學學報,2003,38(2):85-88

[12]顏軍,徐光域,郭曉強,等.銀耳粗多糖的純化及抗氧化活性研究[J].食品科學,2005,26(9):169-172

[13]Marx J L.Oxygen free radicals linked to many diseases[J].Science,1987,235(4788):529

[14]李棣華,劉俊紅,伍孝先.紫外可見分光光度法測定不同產地柴胡中多糖含量[J].天津中醫藥,2010,21(4):342-343

[15]張遠榮,蔣企洲.馬齒莧多糖清除羥自由基作用的研究[J].首都醫藥,2009(9):48-49

[16]孫仕玲.山藥多糖含量的測定方法研究[J].農業與技術,2010,30(3):35-39

The Comparison of the Polysaccharides Obtained from Six Different Edible Fungus Mycelia

XIONG Fang,SUN Shu-jing,XIAO Ying,HU Kai-hui*
（College of Life Sciences,Fujian Agricultural and Forest University,Fuzhou 350002,Fujian,China）

The polysaccharides from Lentinus edodes,Plurotus sajorcaju,Flammulina velutiper,Pleurotus geesteranus,Agrocybe chaxingu and Ganoderma lucidum mycelium were extracted by boiling water method,and the content of polysaccharides was measured by Phenol-Sulfuric Acid Method.The results showed that the contents of polysaccharides in the six mushroom mycelium were 4.84%,3.45%,7.72%,3.14%,11.18%and 5.22%.At the same time,the antioxidant activity of the six polysaccharides was determined through the determination of hydroxyl radical scavenging capacity.The results showed that although Agrocybe chaxingu contained the highest of polysaccharide,the weakest of hydroxyl radical scavenging capacity;Flammulina velutiper,Ganoderma lucidum and Lentinus edodes,not only had more polysaccharide,and the ability of clearing hydroxyl radical was better,among them.In comparison,the polysaccharide from Flammulina velutiper has a wider development foreground.

edible fungus;mycelium;polysaccharide;antioxidant;hydroxyl radical

福建省教育廳科技項目（JA09097）

熊芳（1983—），女（漢），助理實驗師，碩士，食用菌活性物質開發與利用。*

2011-12-07