HPLC法測定3種雜交翠菊花色苷的含量

陳亮，李公斌，辛秀蘭，袁其朋

（1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2.淄博職業學院，山東 淄博 255314；3.北京電子科技職業學院，北京 100029）

HPLC法測定3種雜交翠菊花色苷的含量

陳亮1，3，李公斌2，辛秀蘭3，袁其朋1，*

（1.北京化工大學生命科學與技術學院，北京 100029；2.淄博職業學院，山東 淄博 255314；3.北京電子科技職業學院，北京 100029）

采用高效液相色譜法（HPLC）對3種不同顏色的雜交翠菊花色苷含量進行測定。使用1%鹽酸甲醇溶液分別對3種不同顏色翠菊花色苷進行提取,以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對照品,使用Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-5%甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫,流速為1 mL/min，檢測波長為520 nm。結果表明，粉紅色、紫紅色、藍紫色3種雜交翠菊花色苷含量分別為168.15、614.89、193.89 mg/100 g，紫紅色雜交翠菊具有較好的應用開發價值。

翠菊；花色苷；高效液相色譜法

翠菊[Callistephus chinensis（Linn.）Nees]屬于菊科（Compositae）翠菊屬（Callistephus）的單型種，一年生草本植物、淺根性、莖直立、多分枝、葉互生、頭狀花序、舌狀花。生長于山坡拋荒地、山坡草叢、水邊或疏林蔭處。主產于我國吉林、遼寧、河北、山西、山東、云南及四川等省。翠菊是重要的露地綠化用花卉，同時也是重要的盆栽觀賞花卉[1]。

翠菊色彩豐富艷麗，有紫紅、桃紅、藍紫等色,尤其是2000年劉振廷先生發現翠菊雄性不育株，并在世界上首先培育出翠菊的雜交品種，翠菊的顏色愈發的多樣化，且易于人工控制，為翠菊市場的開拓與發展提供了有效的途徑。同時，花色的不同，其所含的天然水溶性色素花色苷成分的種類和含量亦有很大的不同，目前天然食用色素因其良好的安全性、天然著色效果以及抗氧化、抗衰老、抗突變等優良生理活性[2-3]，頗受人們青睞，而人工合成色素日益暴露出諸多弊病，因此，研究開發翠菊花色苷具有很重要的發展應用前景。

目前，測定花色苷的含量主要有pH示差法、直接測定法和HPLC法，pH示差法是傳統的、經典的、無需對照品的測定方法。而直接測定法和HPLC法需要對照品，且對照品不易獲得、較為昂貴，一度限制了方法的廣泛應用，但是HPLC法可以獲得更多的樣品信息，除了可以測定總的花色苷含量，還可根據色譜峰的個數推斷花色苷種類的數量以及相對含量，能夠更為直觀、快速、簡便的了解樣品，同時也為翠菊品種的質量控制（如：采收期、品種、儲藏、加工等）提供了有效的借鑒[4-6]。

對3種不同顏色雜交翠菊花色苷的提取及測定進行了研究，為其開發利用提供科學參考。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀（DAD）：美國安捷倫公司；冷凍高速離心機：Sigma 3K15；HZQ-Q振蕩器：哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.2 主要材料

新鮮盛花期雜交翠菊（Callistephus chinensis表觀顏色：Ⅰ粉紅色；Ⅱ紫紅色；Ⅲ藍紫色）：湖北富程生物技術有限公司提供；花色苷對照品（矢車菊-3-O-葡萄糖苷，純度>98%）：成都曼思特生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：ZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：溶劑A為甲醇；溶劑B為5%甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，5%～24%甲醇（A）；10 min～15 min，24%；15 min～30 min，24%～35%；30 min～35 min，35%；35 min～50 min，35%～50%；流速：1.0 mL/min；檢測波長520 nm；掃描波長：260 nm～600 nm；柱溫30℃。

2.2 標準品溶液的制備及線性關系考察

精確稱取矢車菊-3-O-葡萄糖苷對照品10 mg溶于10 mL 1%鹽酸甲醇溶液，進樣0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μL，各重復進樣3次，計算3次平均峰面積。將峰面積Y與進樣量X進行直線回歸分析，對照品在0～6.4 μg范圍內有良好的線性關系，回歸方程為：Y=1561.1X-7.3，相關系數 R2=0.9998，見圖 1。

圖1 對照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of the standard(cyn-3-O-glu)

2.3 樣品的制備

稱取3種不同顏色樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，搗碎，分別溶于1%（體積比）HCl甲醇溶液中，振蕩器低速低溫振蕩提取2 h，靜置過夜，7000 r/min高速離心10 min，殘渣再另加提取溶劑，振蕩浸提離心洗滌至無色，合并3次上清液，分別定容至25 mL，備用。

2.4 精密度試驗

吸取一定量矢車菊-3-O-葡萄糖苷溶液，連續進樣5次，測定峰面積。測得RSD為1.27%，表明進樣精密度良好。

2.5 穩定性試驗

吸取一定量矢車菊-3-O-葡萄糖苷溶液，隔4 h進樣測5次，測定峰面積。測得RSD為1.46%，表明方法的穩定性良好。

2.6 樣品花色苷含量的測定

取1mL提取液，過0.45 μm濾膜后吸取一定量續濾液進樣，測定峰面積，按照色譜條件進行測定并根據外標法計算出花色苷的總含量，見表1。

表1 3種不同顏色翠菊花色苷含量Table 1 The anthocyanin content of three hybrid callistephus chinensis with different colors

由測定峰面積及公式計算出3種不同顏色翠菊的花色苷含量，此外，通過3次重復試驗，表明試驗的重現性良好。

2.7 回收率試驗

取3種不同顏色樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3份，精密吸取矢車菊-3-O-葡萄糖苷對照品溶液1 mL，按照2.3的步驟制樣，測定峰面積。結果表明：對照品的平均回收率分別為98.37%、96.85%、99.01%，RSD分別為2.33%、2.26%、2.51%，由此建立了HPLC測定翠菊花色苷含量的方法，此方法快速、簡便、可靠。

3 結論

3.1 HPLC測定方法的探討

運用HPLC法測定總花色苷的含量應注意幾點問題：1.選擇合適的色譜條件，色譜條件應最大限度的使各個色譜峰實現基線的分離，色譜峰的重疊將導致總花色苷的含量降低；2.選擇合適的色譜柱，一般的色譜柱測定的pH范圍在2～8，SB-C18色譜柱的pH范圍在1～9，可以有效地避免5%的甲酸水溶液對色譜柱的損害；3.保證對照品和供試品的測定條件相同，如pH、溫度，在不同的pH下，花色苷的最大吸收波長和峰面積會發生變化；4.花色苷提取液經過樹脂純化將會導致花色苷含量不同程度的降低；5.根據不同的標準品計算的總花色苷結果會有差異。

3.2 雜交翠菊花色苷的研究開發意義

雜交翠菊生態適應性和傳統翠菊無異，栽培要求條件不高，我國北方大部分地區均可種植，其畝產量可達2000 kg，本文通過對HPLC測定發現紫紅色雜交翠菊花色苷含量較高，為614.89 mg/100 g鮮重，對開發高產、高效、高附加值的天然色素具有重要的意義，因此，研究雜交翠菊天然色素具有廣闊的前景和重要的意義。

[1]傅壯.中國農業百科全書:觀賞園藝卷[M].北京:中國農業出版社,1996:347

[2]Bridle P,Timberlake C F.Anthocyanins as natural food coloursselected aspects[J].Food chemistry,1997,58(2):103-109

[3]Juan Carlos Espin,Cristina Soler-Rivas,Harry J Wichers,et al.Anthocyanin-based natural colorants:A new source of antiradical activity for foodstuff[J].J Agric Food Chem,2000,48(5):1588-1592

[4]Jungmin Lee,Christopher Rennaker,Ronald E Wrolstad.Correlation of two anthocyanin quantification methods:HPLC and spectrophotometric methods[J].Food chemistry,2008,110(3):782-786

[5]Luigi Mondello,Antonella Cotroneo,Giacinto Errante,et al.Determination of anthocyanins in blood orange juices by HPLC analysis[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2000,23(1):191-195

[6]Xianli Wu,Ronald L Prior.Systemaic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States:fruits and berries[J].J Agric Food Chem,2005,53(7):2589-2599

Determination of Anthocyanin Content in Hybrid Callistephus Chinensis by HPLC

CHEN Liang1,3,LI Gong-bin2,XIN Xiu-lan3,YUAN Qi-peng1,*
（1.College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China;2.Zibo Vocational College,Zibo 255314,Shandong,China;3.Beijing Vocational College of Electronic Science,Beijing 100029,China）

To determine the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis with different colors.The sample was extracted with methanol of 1%HCl,the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis has been detected by HPLC using cyanidin-3-O-glucoside(cy-3-O-glu)as standard.The analysis was carried on Zorbax SB-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was methanol-5%formic acidwater at the flow rate of 1 mL/min,the detection wavelength was 520 nm.Results and conclusion were that the anthocyaninscontentsinthreecallistephuschinensiswithpink,purpleandblue-violetcolorswere168.15mg/100g,614.89 mg/100 g and 193.89 mg/100 g,respectively.It was valuable to exploit the hybrid callistephus chinensis with purple color.

hybrid callistephus chinensis;anthocyanin;HPLC

北京市屬高等學校人才強教深化計劃資助項目；山東省高等學校優秀青年教師國內訪問學者項目；科研基地-生物技術在制藥和農產品加工中的應用平臺建設（PXM2010_014306_109857）

陳亮（1986—），男（漢），博士研究生，研究方向：天然產物分離。

*通信作者

2011-12-14