高效液相色譜法檢測富硒酵母中的硒代蛋氨酸

韋淑毅，鐘其頂，高紅波，邢江濤，王道兵，熊正河，*，王歲樓

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100027）

高效液相色譜法檢測富硒酵母中的硒代蛋氨酸

韋淑毅1，2，鐘其頂2，高紅波2，邢江濤2，王道兵2，熊正河2，*，王歲樓1，*

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.中國食品發酵工業研究院，北京 100027）

建立了高效液相色譜法測定富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。采用酶解提取法提取富硒酵母樣品中的硒代蛋氨酸，丹磺酰氯柱前衍生，C18色譜柱（4.6 mm×250 mm i.d.,5 μm）分離，以10 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（含4%N，N-二甲基甲酰胺，pH=6.55）和乙腈為流動相進行梯度洗脫，熒光檢測（激發波長：320 nm；發射波長：523nm）。硒代蛋氨酸的檢出限為（S/N=3）1 μg/L，定量限為（S/N=10）5 μg/L。在 1 mg/L～50 mg/L 范圍內的線性關系良好（R≥0.9996）。加標回收率在91.12%～107.83%，方法相對標準偏差＜1.2%。本方法具有專屬性好，靈敏度高，適用于富硒酵母原料及相關產品中的硒代蛋氨酸的定量測定。

富硒酵母；硒代蛋氨酸；丹磺酰氯；高效液相色譜法

硒（Selenium，Se）是人體必需微量元素，存在于抗氧化酶和甲狀腺素代謝酶的活性中心[1-2]，缺硒導致克山病，合理補硒可有效減少人類及動物罹患癌癥的風險[3]。蛋氨酸中硫被硒取代后得到硒代蛋氨酸（Selenomethionine，SeMet），是生物利用度最高的有機硒化物[4]，人體吸收后可在體內形成硒儲備池[5]。富硒酵母是被廣泛研究的食品硒補充劑[6]，在培養基中加入無機硒，利用酵母將難吸收的無機硒源轉化為易吸收的有機硒源[7]。Clark等[8]的臨床研究證明將富硒酵母納入飲食中作為硒補充劑可減少大約50%的癌癥發病率與死亡率。作為硒代蛋氨酸的最經濟來源，富硒酵母中總硒的70%～76%以硒代蛋氨酸的形式存在[9-10]，富硒酵母中硒代蛋氨酸的含量對評價其質量與營養價值具有重要意義。

目前，國外測定富硒酵母中硒代蛋氨酸的方法有高效液相色譜串聯電感耦合等離子體質譜法（HPLC-ICP-MS），高效液相色譜串聯質譜法（HPLC－MS），毛細管電泳-電化學發光法（CE-ECL）等，國內相關文獻較少。Chassaigne等[11]采用稀酸提取，HPLC-ICP-MS進行富硒酵母中有機硒檢測；Po覥atajko等[12]采用水溶液超聲提取，HPLC-MS檢測富硒酵母中硒代蛋氨酸；以上方法采用色譜-質譜聯用儀器昂貴，使其應用受到一定限制。Deng等[13]采用稀酸提取，CE-ECL檢測富硒酵母中硒代蛋氨酸；但電泳方法的重現性不高。考慮到以上方法的不足以及現實生產應用中對檢測方法的要求——需兼顧準確性與經濟性，本實驗針對富硒酵母中硒代蛋氨酸進行分析，采用酶解法進行樣品提取，通過對樣品的色譜分離及衍生等條件進行研究，建立了丹磺酰氯（DNS-Cl）柱前衍生高效液相色譜—熒光法測定富硒酵母中硒代蛋氨酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒酵母原料（硒含量2000 μg/g）：安琪酵母有限公司；硒代蛋氨酸（≥98%）：J&K，SCIENTIFIC LTD；丹磺酰氯（≥98%）：ACR譫S ORGANICS；蛋白酶 XIV：Sigma：乙腈（色譜級）：Fisher Scientific；鹽酸（優級純）、無水碳酸鈉（分析純）、氫氧化鈉（分析純）均為北京化工廠生產；甲胺鹽酸鹽（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（分析純）：西隴化工股份有限公司；磷酸二氫鈉（分析純）：上海試劑總廠；實驗用水為Milli-Q水。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀配熒光檢測器：美國Waters公司；WH-861型旋渦混合振蕩器：太倉市科教儀器廠；pHS-3C型酸度計：上海雷磁儀器廠；THERM Ostar-95型數顯恒溫水浴鍋：浙江省輕工業研究所；HC-3518型高速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；THZ-Q型臺式冷凍恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；AB204-N型萬分之一分析天平：MettlerToledo。

1.3 測定方法

1.3.1 標準儲備溶液的配制

稱取適量硒代蛋氨酸標準品，用Milli-Q水制成1.0 mg/L的硒代蛋氨酸標準儲備液。稱取適量17種常見氨基酸，用0.1 mol/L鹽酸配成1.0 mg/L的氨基酸混標溶液，以上溶液均置4℃冰箱冷凍保藏[14]。

1.3.2 樣品前處理條件

1.3.2.1 樣品提取

稱取0.1 g經冷凍研磨的富硒酵母原料（或0.5 g富硒酵母產品），置于10mL離心管中，加入5mL0.05mol/L磷酸氫鈉緩沖液（pH=7.4），40 mg蛋白酶XIV，充分混勻后于37℃搖床振搖24 h。振搖結束后向樣品酶解液中加入0.1 mL 1.5 g/L亞鐵氰化鉀溶液及0.1 mL 3 g/L乙酸鋅溶液，充分混勻后在3000 r/min下離心10 min，取上清液待測，用80 mmol/L碳酸鈉緩沖液（用1 mol/L HCl調節pH至9.5）適當稀釋，使樣品含量在方法線性范圍內。

1.3.2.2 樣品衍生

取1 mL稀釋后的酶解液于5 mL離心管中，加入1 mL 80 mmol/L碳酸鈉緩沖液（pH=9.5），1 mL丹磺酰氯（6.0 mg/L，乙腈介質），渦旋混勻，于60℃水浴避光衍生2 h，加入0.1 mL 20 mg/mL鹽酸甲胺溶液終止衍生反應。避光放置15 min，0.22 μm有機微孔濾膜過濾上機檢測。

取1 mL系列不同濃度的硒代蛋氨酸標準工作液，按照如上方法進行衍生。

1.3.3 色譜條件

Pursuit XRs C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm)；熒光檢測器：激發光波長：320 nm，發射波長：523 nm；柱溫30℃；進樣量為10 μL；流動相為乙腈-10 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（含4%N，N-二甲基甲酰胺pH=6.55）[15]；流速為 1.0 mL/min，梯度洗脫程序：（T，乙腈%）0 min，14%；5 min，20%；10 min，25%；12 min，25.6%；15 min，25.7%；19 min，25.9%；23 min，26.5%；30 min，27%；34 min，30%；38 min，43%；41 min，68%；45 min，68%；47 min，86%；52 min，86%。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 硒代蛋氨酸提取方法的選擇

酵母細胞壁主要由β-葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白以及丁幾質構成，比較了超聲水溶液提取法與酶解提取法的提取效率,前者按Casiot等[16]所述操作，后者按1.3.2節所述操作。結果顯示，酶解提取液中硒代蛋氨酸濃度為水溶液提取液的30倍，說明富硒酵母中硒代蛋氨酸主要以蛋白結合形態存在，因此本試驗采用酶解提取法提取游離態及結合態的硒代蛋氨酸。

2.1.2 蛋白酶XIV用量選擇

平行取5份0.1 g富硒酵母原料樣品，分別加入5、10、20、40、60 mg 蛋白酶 XIV，按照實驗方法酶解測定，酶量在5 mg～40 mg時硒代蛋氨酸的面積隨酶量增加而增大，在40 mg～60 mg時硒代蛋氨酸的面積變化較小，說明40 mg蛋白酶XIV已經將結合態的硒代蛋氨酸完全釋放出來，結果如圖1，因此本試驗采用蛋白酶XIV的用量為40 mg。

圖1 不同蛋白酶XIV使用量對酶解效率的影響Fig.1 Effect of different protease XIV usages on enzymatic efficiency

2.1.3 衍生條件的優化

在25℃的碳酸鈉緩沖體系中，丹磺酰氯與一級、二級甚至三級氨基官能團進行熒光標記，靈敏度達1 μg/L[17]，反應 pH、衍生劑濃度、衍生溫度與時間都對衍生反應產率有一定的影響[18]。相關文獻[15，19-21]提及，當反應緩沖體系pH為9.5時，衍生效果最好；在前人研究的基礎上，本試驗采用80 mmol/L（pH 9.5）碳酸鈉緩沖液為衍生反應溶液，衍生溫度為60℃，重點對衍生劑濃度與衍生時間進行了優化。

以富硒酵母原料為待測樣品，綜合考察在不同衍生劑濃度及衍生時間下加標回收率的水平，結果如表1所示，當丹磺酰氯濃度為6.0 mg/L，衍生時間為2 h時，回收率較理想。

2.2 色譜條件的優化

富硒酵母基質中含有多種氨基酸對硒代蛋氨酸的測定產生一定的干擾，試驗采用10 mmol/L磷酸氫鈉緩沖液（含 4%N，N-二甲基二甲胺，pH 6.55）-乙腈為流動相[15]，依據的酵母基質特性對梯度洗脫的方法進行了優化，最終在1.3.3色譜條件下，酵母中常見的17種氨基酸與硒代蛋氨酸獲得了良好分離，圖2為17種常見氨基酸與硒代蛋氨酸衍生物的色譜圖,圖3為酵母樣品衍生的色譜圖。

表1 不同衍生試劑濃度與衍生時間下所得的加標回收率Table 1 The recovery of spiked sample extract with different DNS-Cl concentrations and derivative time

圖2 17種常見氨基酸與硒代蛋氨酸混標衍生物的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of the standards of 17 common amino acids and selenomethionine

圖3 富硒酵母樣品衍生的色譜圖Fig.3 Chromatogram of selenium-enriched yeast

2.3 方法的線性范圍與檢出限、定量限

取硒代蛋氨酸儲備溶液逐級稀釋成1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的系列標準工作液，按試驗方法衍生后測定，以峰面積y為縱坐標，質量濃度x（mg/L）為橫坐標繪制標準工作曲線。結果表明：在1.0 mg/L～50.0 mg/L時，硒代蛋氨酸質量濃度與峰面積有良好的線性關系（r=0.9996），回歸方程 y=122459x-48813，檢出限（以S/N=3計）為1 μg/L，定量限（以S/N=10計）為 5 μg/L。

2.4 方法的重復性

取同一份富硒酵母樣品6份，按照上述方法測定硒代蛋氨酸含量，方法的相對標準偏差小于1.2%，表明該方法具有良好的重復性。

2.5 加標回收率實驗

取富硒酵母樣品4份，加入不同量硒代蛋氨酸標準液，按照試驗方法測定，計算加標回收率。由表2可見，硒代蛋氨酸的加標回收率在91.12%～107.83%之間。

表2 硒代蛋氨酸加標回收率實驗Table 2 Recovery results of standard addition of selenomethionine in yeast enzymatic extrat

2.6 富硒酵母樣品中硒代蛋氨酸的測定

根據建立的方法對5種不同富硒酵母樣品及普通酵母進行檢測，結果見表3。

表3 富硒酵母原料及產品中硒代蛋氨酸的測定結果Table 3 The detection results of selenomethionine in seleniumenriched yeasts materials and related products

3 結論

本文建立了丹磺酰氯柱前衍生-高效液相色譜法檢測富硒酵母中硒代蛋氨酸的分析方法。重點對樣品提取方法和衍生方法進行了研究。1）樣品提取方法研究：對酶解提取和超聲提取富硒酵母中硒代蛋氨酸方法進行比較，結果表明酶解法測定結果遠大于超聲水溶液提取法，并對酶用量進行優化，有效提高了富硒酵母中硒代蛋氨酸的提取效率。2）硒代蛋氨酸衍生及分離條件研究：選擇丹磺酰氯進行柱前衍生，并對衍生劑濃度及衍生時間進行了優化，采用磷酸二氫鈉緩沖液和乙腈進行梯度洗脫，硒代蛋氨酸與富硒酵母中常見氨基酸及其它基質干擾組分得到有效的分離；方法加標回收率在91.12%～107.83%之間，相對標準偏差＜1.2%。該方法相對于液相色譜-ICP質譜法，普及性強，操作簡單，兼顧準確性和經濟性等特點，適合運用于實際生產對富硒酵母中硒代蛋氨酸進行定量分析。

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Determination of Selenomethionine in Selenium-enriched Yeast by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography

WEI Shu-yi1,2,ZHONG Qi-ding2,GAO Hong-bo2,XING Jiang-tao2,WANG Dao-bing2,XIONG Zheng-he2,*,WANG Sui-lou1,*
（1.China Pharmacutical University,Nanjing 210009,Jiangsu,China;2.National Research Institute of Food&Fermentation Industries,Beijing 100027,China）

The high performance liquid chromatography detection methods for selenomethionine in seleniumenriched yeast is established,which utilizes protein enzymes for selenomethionine extraction,dansyl chloride for derivatizaiton,C18reverse column(4.6 mm×250 mm i.d.,5 μm)for seperation,10 mmol/L phosphate buffer solution and acetonitrile for gradient elution,fluorescent detector(λex:320 nm;λem:523 nm)for determination.The detection limit(S/N=3)is 1 μg/L,and quantification limit(S/N=10)is 5 μg/L.Detection of 1 to 50 mg/L selenomethionine produces a linear response(R≥0.9996)and the recovery is quantitative around 91.12%-107.83%,the RSD<1.2%.The present methods is speficitive,sensitive,economatic and accurate,and be used in the determination of selenomethionine for the selenium-enriched yeasts materials and relating products.

selenomethionine;selenium-enriched yeast;dansyl chloride;hige performance liquid chromatography

韋淑毅（1986—），女（壯），碩士研究生，主要從事富硒酵母中活性成分的檢測技術研究。

*通信作者1：熊正河（1957—），女，教授級高工，研究方向：發酵類食品標準的研究與制定。

*通信作者2：王歲樓（1961—），男，教授，博士生導師，工學博士，藥物分析學科食品質量與安全方向。

2012-03-13