α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法的研究

朱文佳，寇自農，張曦，付紹平，朱靖博，3，*，蕭偉

（1.大連工業大學食品學院，植物資源化學與應用研究所，遼寧 大連 116034；2.大連工業大學現代教育技術部，遼寧 大連 116034；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室（籌）,江蘇 連云港 222001；4.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法的研究

朱文佳1，寇自農2，張曦1，付紹平1，朱靖博1，3，*，蕭偉3，4

（1.大連工業大學食品學院，植物資源化學與應用研究所，遼寧 大連 116034；2.大連工業大學現代教育技術部，遼寧 大連 116034；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室（籌）,江蘇 連云港 222001；4.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

以對-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物，通過高效液相色譜定量分析水解產物對-硝基苯酚，確定α-葡萄糖苷酶的活性，建立新的α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選方法，為了提高篩選方法的靈敏度，對酶促反應條件進行了優化，并用阿卡波糖驗證篩選方法的可靠性，結果測得阿卡波糖的IC50為2.07 mg/mL，與文獻報道相近，說明該法可替代傳統的Trembly法，并可用于α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選。

α-葡萄糖苷酶抑制劑；高效液相色譜；篩選模型；糖尿病；酶動力學

糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成為嚴重威脅人類健康的主要慢性病之一[1]。糖尿病人餐后高血糖加重糖尿病并引發各種并發癥，是導致患者死亡的主要原因。α-葡萄糖苷酶抑制劑（α-glucosidase inhibitors，α-GI）能有效控制餐后高血糖，且不導致低血糖[2]；另外，α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以通過調節α-葡萄糖苷酶的活性治療病毒感染、腫瘤、溶酶體貯積癥[3]、肥胖、高三酰甘油血脂癥[4]等多種疾病。目前，臨床應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑都是生物合成或半合成藥，種類少、價格貴、副作用大。因此，從天然產物中篩選新的α-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究的熱點[5]。

高通量篩選（high throughout screening，HTS）是新藥發現的重要步驟。目前，α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選方法主要有對-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pnitrophenyl-α-D-galactopyranoside，PNPG）法[6]、葡萄糖氧化酶法[7]和固定化酶法[8]，普遍采用分光光度法作為檢測手段，試劑消耗大、重現性差，尤其對于復雜樣品或有色素干擾樣品的篩選，假陽性高[9]。本研究首次利用高效液相色譜結合酶反應動力學的原理，對反應中酶濃度、底物濃度、終止劑用量和反應時間等條件進行優化，建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選模型，提高了篩選的靈敏度和準確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

HWS 26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；SK-1型快速混勻器：常州國華儀器有限公司；PNS-3C型pH酸度計：上海鵬順科學儀器有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜分析儀：美國戴安公司；微量進樣器：寧波市鎮海玻璃儀器廠；1.5 mL離心管：美國Axygen公司；0.45 μm濾膜：上海密粒膜分離技術有限公司。

1.1.2 試劑

PNPG（純度99%）：、α-葡萄糖苷酶（純度≥10U/mg）、啤酒酵母、牛血清白蛋白（BSA，純度≥95%）：sigma公司；阿卡波糖（Acarbose，批號 AC-0808040）：湖南新匯制藥有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參考Li[10]的方法，實驗以PNPG為底物，通過HPLC 檢測產物對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）的變化，確定α-葡萄糖苷酶的活性。實驗在1.5 mL離心管中進行，反應總體積為 160 μL：10 μL 0.067 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液，30 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，40 μL 4.0 mmol/L PNPG，振蕩混勻，37 ℃反應 30 min，加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3終止反應，加超純水稀釋至500 μL，振蕩混勻，用0.45 μm膜過濾后上HPLC檢測。實驗設置空白對照（以等體積的磷酸鹽緩沖溶液代替酶液）和陽性對照（以等體積的Acarbose代替磷酸鹽緩沖溶液）。按照下式計算抑制率：

式中：A為陽性對照中PNP的濃度（扣除相應空白，mmol/L）；B為陰性對照中PNP的濃度（扣除相應空白，mmol/L）。

1.2.2 PNP的HPLC定量分析

色譜條件：Sino Chrom ODS-BP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱；流動相：A為乙腈，B為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫條件為0～8min，20%～30%A；8min～13 min，30%～80%A；13 min～18 min，80%～20%A；18 min～28 min，20%A）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：常溫；檢測波長：314 nm。

標準曲線的制作：精確稱取0.0209 g PNP標準品，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解，定容于25 mL容量瓶中，配置成6 mmol/L的PNP母液，將母液稀釋成0.0025、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L。按照上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.2.3 酶穩定性研究

將酶凍干粉用pH 6.8的0.067 mol/L的含0.2%BSA的磷酸鹽緩沖溶液配置成0.1 U/mL的酶液，將酶保存在冰水中，分別在 0、4、12、24、72、120、168、240 h取上述酶液按照1.2.1的方法反應，觀察酶活性變化。

1.2.4 酶促反應條件的優化

1.2.4.1 終止劑用量的選擇

按照 1.2.1 的方法，實驗分別加入 10、20、40、60、80、100、120 μL Na2CO3終止反應，觀察酶活性變化。1.2.4.2 酶濃度和反應時間的選擇

按照1.2.4.1確定的條件，實驗測定不同酶用量（10、20、25、30、35、40 μL）下產物 PNP 的變化。

1.2.4.3 反應時間的選擇

按照1.2.4.2確定的條件，實驗測定不同反應時間（5、10、20、30、40、50、60 min）下產物 PNP 的變化。

1.2.4.4 底物濃度的選擇

按照1.2.4.3確定的條件，實驗分別測定不同底物濃度（0.135、0.27、0.6、1.0、1.2、1.8、2.4、3.0 mmol/L）在不同時間間隔（0、3、6、9、12、15、30、90、150、210、270 min）下PNP的變化。

1.2.4.5 孵育時間的選擇

按照1.2.4.4確定的條件，實驗分別測定α-葡萄糖苷酶與 Acarbose在一定孵育時間（5、10、15、20、30、40、50、60 min）下產物 PNP 的量。

1.2.5 Acarbose的IC50的測定

在1.2.4.5確定的最佳反應條件下，測定反應體系中不同濃度的 Acarbose（0.25、0.625、1.25、1.875、2.5、3.125、3.75、5.0、6.25、7.5、8.75 mg/mL）對 α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2 結果與討論

2.1 PNP標準工作曲線

按照1.2.2的方法繪制標準曲線，求得回歸方程為y=197.4x+0.8193，R2=0.9998，說明 PNP 在 0.0025mmol/L～0.8 mmol/L范圍內線性關系良好。PNP標準工作曲線見圖1。

圖1 PNP標準工作曲線Fig.1 Working curve of PNP

2.2 溫度和pH的選擇

通常37℃時Km數量級為10-2，酶活性較大，實驗采用人體正常體溫37℃和小腸內α-葡萄糖苷酶的弱酸環境pH 6.8作為反應條件。

2.3 放置時間對酶活性的影響

低濃度時α-葡萄糖苷酶亞基容易解離，而且酶容易吸附到容器壁上并容易引起表面變性[11]，實驗加入BSA防止這種低濃度的失效。放置時間對產物PNP濃度的影響見圖2。

圖2 放置時間對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Effect of the placing time on α-glucosidase activity

從圖2可以明顯看出，α-葡萄糖苷酶在冰水浴中放置240 h，水解產生PNP的量基本恒定，說明實驗配制的α-葡萄糖苷酶溶液在冰水浴中放置240 h酶活穩定。

2.4 酶促反應條件的優化

2.4.1 終止劑濃度對酶活性的影響

為了快速、完全的終止反應，準確測量一定時間內α-葡萄糖苷酶水解底物的量，實驗加入一定體積的Na2CO3改變溶液pH，使酶失活，達到終止反應的目的。Na2CO3濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響見圖3。

從圖3可以看出，當反應體系加入10 μL～60 μL Na2CO3時，酶促反應不能及時、完全被終止，α-葡萄糖苷酶在室溫條件下繼續水解底物，產物PNP的量不斷增加；當 Na2CO3的加入量達到 60 μL～120 μL 時，產物PNP的濃度基本不變，說明酶促反應被終止，此時PNP的量能真實反應酶活大小，因此實驗選擇80 μL Na2CO3終止反應。

圖3 終止劑對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of the terminator on α-glucosidase activity

2.4.2 酶濃度對反應速率的影響

α-葡萄糖苷酶的濃度對產物PNP濃度的影響見圖4，不同酶濃度下水解產物PNP的HPLC圖見圖5。

圖4 α-葡萄糖苷酶濃度對水解反應影響Fig.4 Effect of the concentration of α-glucosidase on the hydrolysis reaction

Fig.5 HPLC chromatogram of PNP with different concentration of α-glucosidase

對于酶促反應，速度總是與酶濃度成正比[12]，隨著酶用量的增加，相同時間內水解產物PNP的量隨之增加，當加入酶量達到30 μL時，從相應液相色譜圖（圖5）中可看到明顯的峰高的變化，因此實驗選擇反應酶量為 30 μL。

2.4.3 水解時間對反應速率的影響

延長反應時間，也可以增加產物的生成，如圖6所示，當水解到30 min時，從相應色譜圖上（圖7）可以看到明顯的峰形變化，因此實驗選擇反應時間為30 min。水解時間對產物PNP濃度的影響見圖6；不同水解時間下產物PNP的HPLC圖見圖7。

圖6 水解時間對水解反應的影響Fig.6 Effect of the hydrolysis time on the hydrolysis reaction

圖7 不同水解時間下PNP的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatogram of PNP with different hydrolysis time

2.4.4 底物濃度對反應速率的影響

酶促反應動力學中一般用酶促反應的初速度量度反應速度，為測定酶促反應速度，實驗首先繪制不同底物濃度下酶促反應的過程曲線，如圖8所示。

圖8 不同底物濃度的酶促反應過程曲線Fig.8 Curves of the enzyme-catalyzed reaction of different substrate concentrations

從圖8可以看出，反應速度（曲線斜率）隨時間延長而減小。酶促反應中底物向產物轉化低于20%時，過程曲線一般是線性的，因此實驗用線性回歸法得到這條切線的斜率，即初速度，見表1，根據米氏方程：

但是這樣得到的K m值并不準確，實驗利用Lineweaver-Burk作圖法對這條曲線進行擬合[13]，繪得圖9，橫軸截距為-1/Km，因此求得K m=0.447 mmol/L≈0.4 mmol/L，實驗選擇的底物濃度范圍為0.36 Km～8.0 Km，因此實驗測得的K m值較準確[12]。

底物濃度是影響酶促反應的重要因素，為準確、可重復的獲得α-葡萄糖苷酶的活性，首先要消除底物濃度對酶促反應的影響。一定酶濃度下，酶促反應首先表現為一級反應；隨著底物濃度的增加，反應最后表現為零級反應，反應速度不隨底物濃度的增加而上升，而是趨近Vmax，說明酶已經被底物飽和。一般認為[S]≥10 Km時，酶被底物充分飽和，反應速度不受底物濃度影響，因此，實驗選取底物濃度[S]=10 Km，即4.0 mmol/L為底物濃度。

表1 不同底物濃度的酶促反應初速度Table 1 Initial velocity of enzyme-catalyzed reaction of different substrate concentrations

圖9 不同底物濃度的雙倒數圖Fig.9 Double-reciprocal of different substrate concentration

2.4.5 孵育時間對酶抑制活性的影響

抑制劑與酶結合并發揮抑制作用，往往需要一定的時間，實驗以臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑Acarbose研究孵育時間對酶活性的影響見圖10。從圖10孵育時間對酶活性的影響中可明顯看出，孵育時間影響Acarbose對酶的抑制作用，時間過短Acarbose與酶結合不穩定，孵育20 min后抑制率基本恒定，說明抑制劑很好的抑制了α-葡萄糖苷酶的活性，而這可能與Acarbose與酶活性中心的結合特性有關。因此實驗選擇孵育20 min。

圖10 孵育時間對Acarbose抑制效果的影響Fig.10 Effect of the inbubation time on the inhibition rate of Acarbose

2.5 模型驗證

Acarbose對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有良好的量效關系，隨著抑制劑濃度的增加，抑制率逐漸增強，Acarbose的濃度對酶活性的影響見圖11。

圖11 Acarbose對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.11 Inhibitory effect of acarbose on α-glucosidase actibity

通過半抑制率計算軟件計算出Acarbose的IC50=2.07 mg/mL。

3 結論

研究以PNPG為底物，采用HPLC對α-葡萄糖苷酶進行動力學分析，建立了體外篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。研究確定了α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法的最佳條件：10 μL 0.067 mol/L，pH6.8 的磷酸鹽緩沖溶液、30 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，振蕩混勻，37 ℃孵育20 min，加入40 μL 4.0 mmol/L PNPG開啟反應，振蕩混勻，37℃反應30 min后，加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止反應，加超純水稀釋至500 μL，振蕩混勻，經0.45 μm膜過濾后，用HPLC檢測，通過產物PNP的濃度變化，計算α-葡萄糖苷酶的活性。實驗過程中發現底物PNPG易自發水解，因此每組實驗均設置空白對照。

篩選方法經Acarbose驗證，確定IC50為2.07mg/mL，與文獻報道相近。說明該方法微量、準確、靈敏、快速，可降低篩選的假陽性，提高從復雜天然產物提取物或復雜樣品中發現新的活性物質的機率。

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Study of Screening Method for α-glucosidase Inhibitors in Vitro

ZHU Wen-jia1,KOU Zi-nong2,ZHANG Xi1,FU Shao-ping1,ZHU Jing-bo1,3,*,XIAO Wei3,4
(1.Institute of Chemistry and Applications of Plant Resources,School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,Liaoning,China;2.Modern Education Technology Branch,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,Liaoning,China;3.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process,Lianyungang 222001,Jiangsu,China;4.Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.,Ltd.,Lianyungang 222001,Jiangsu,China)

A novel screening method for α-glucosidase inhibitors has been established by HPLC in vitro.The enzymatic activities of α-glucosidase were determined by monitoring the release of PNP from the substrate PNPG..In order to improve the detection sensitivity,the conditions of enzyme-catalyzed reaction were optimized.Acarbose was used to validate the established method.The results showed that the IC50values of αglucosidase inhibitors activities of Acarbose was 2.07 mg/mL.Which was closed to the experimental date reported in literatures.So this method could be used as an alternative of traditional method of'Trembly',and it could be used in the high-throughput screening of α-glucosidase inhibitors.

α-glucosidase inhibitors;HPLC;screening model;diabetes mellitus;enzyme kinetics

中藥制藥過程新技術國家重點實驗室開放基金課題（SKL 2010Z0201）

朱文佳（1985—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產物化學與應用。

*通信作者：朱靖博（1963—），男（漢），教授，研究方向：天然產物化學與應用。

2011-12-10