體外培養單個造血干細胞實驗方法的建立

李 喬，紀 慶，王金宏，許 靜，田 晨，程 輝，劉延風，張 娜，程 濤，高瀛岱

(中國醫學科學院血液病醫院(血液學研究所)實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020)

造血干細胞一直是成體干細胞研究中的熱點。基于最近20年以來實驗技術的發展，HSCs的發育分化過程、HSCs池的維持等方面已經有比較透徹的研究。關于造血干、祖細胞的傳統研究方法主要是建立體內、體外的造血模型，已有的實驗方法有:①將HSCs體內移植給受致死劑量照射的受體鼠(體內重建造血能力)［1］。該實驗方法主要是觀察研究HSCs在受體鼠體內歸巢－自我更新－分化產生各系祖細胞－分化產生血液系統的整個造血過程;② 骨髓造血細胞的體外克隆性生長實驗［2］。測定長期培養啟動細胞(long-term culture initiating cells，LTC-IC)在體外基質細胞支持下形成鵝卵石樣區域(CA)實驗，即長周期HSCs體外培養實驗，主要用于測定HSCs在體外有基質細胞支持的條件下自我更新的能力，所需時間8～12周;③ 通過計數BFU-E等各系分化集落［3］，或通過血(細胞)涂片結合人工計數各系細胞比例，可以分析HSCs分化能力與分化水平。

可以看出，研究HSCs的關鍵就在于建立造血模型，并藉此研究HSCs的自我更新和分化能力。傳統的實驗方法主要局限于所需時間久，所需細胞量大，人為因素多(主觀性強)，工作量巨大。因此，當進行大規模化合物篩選時需要設計一種高通量、快速、準確、客觀、重復性強的針對HSCs的藥物篩選實驗方法。本課題建立了一種體外無需基質細胞支持、高通量培養單個HSCs集落形成實驗，培養10～14 d，觀察化合物物對HSCs的作用，為后續的研究和藥物篩選工作打下基礎。

為了驗證實驗方法在篩選化合物時的可靠性，使用了一種小分子化合物(BIO，6-bromoindirubin-3'-oxime)，據文獻報道，BIO通過特異性抑制GSK-3(糖原合成酶激酶-3)的功能，進而激活Wnt信號通路，轉錄可以維持干細胞活性的轉錄因子［4］，具有促進造血干細胞干性維持、增殖與擴增的作用［5］。我們采用第一部分中建立的培養單個HSCs的造血模型，驗證該化合物是否可以促進HSCs的自我更新與增殖，從而驗證實驗方法在化合物篩選方面的可靠性。

1 材料

實驗動物為 C57BL/6J小鼠(SPF級)，♀，4～6周齡(CD34在8周齡以下小鼠中表達［6］)購自中國醫學科學院血液學研究所實驗動物中心;免疫磁珠分選系統(MACS)，購自美天尼公司;流式細胞術檢測分析所需熒光素標記的單克隆抗體及其同型對照，均購自BD公司;重組細胞因子包括小鼠血小板生成素(murine thrombopoietin，mTPO 10 mg·L－1，400× )、小鼠白細胞介素 3(murine interleukin-3，mIL-3 10 mg·L－1，1 000× )、小鼠干細胞因子(murine stem cell factor，mSCF，10 mg·L－1，100× )，人促紅細胞生成素(human erythropoietin，hEPO，50 000 μg·L－1，5 000× )均購于Peprotech公司，無血清培養基(Bit，5×)購于 Stem Cell公司，初生牛血清(NCS)購于Stem Cell公司，L-谷氨酰胺和2-巰基乙醇購于Millipore公司。

2 方法

2.1 小鼠骨髓采集與骨髓細胞懸液的制備 頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取其股骨、脛骨和髂骨，用1 ml注射器吸取培養基反復沖洗骨髓腔。將骨髓細胞懸液反復吹打，用300目的無菌濾網過濾成為單細胞懸液。

2.2 免疫磁珠富集 收集c-kit+細胞 (正篩選):帶有ckit+抗體的磁珠吸附c-kit+細胞，當細胞混合液通過磁場時，被柱子吸附的是c-kit+細胞，具體操作步驟參照MACS操作手冊。

2.3 單克隆抗體標記HSCs 收集免疫磁珠富集后得到的細胞混合液，用單克隆抗體(抗體均購買自BD公司)FITC-anti-CD34，PE-anti-Sca1，APC-anti-c-kit，PE-cy7-anti-Lin(包括PE-cy7-anti-B220、Ter119、Mac-1、CD3、Gr-1、CD4、CD8)，標記60 min。

2.4 HSCs體外培養液的配制 普通培養液:含10%NCS的 HSCs培養基，各組分濃度為:mTPO 25 μg·L－1，mIL-3 10 μg·L－1，mSCF 100 μg·L－1和 hEPO 10 μg·L－1，并添加 L-谷氨酰胺(2 mmol·L－1)，2-巰基乙醇(10 mmol·L－1)，雙抗(青霉素100 kU·L－1，鏈霉素100 mg·L－1)。

含小分子化合物的培養液:基本成分同普通培養液，根據培養液中是否加入藥物分為兩個組，實驗組:3#化合物20 μmol·L－1(化合物用 DMSO 溶解，終濃度為 20 mmol·L－1，1 000×)組(3塊96孔板，即3次重復);空白對照組(只加入相同量的 DMSO，3塊96孔板，分別記為 con1，con2與con3)。

取96孔板，外圈36孔中加入 PBS，100 μl/孔，主要作用是提高濕度，降低培養液的蒸發，保證細胞生長所需濕度。中間6排(B～G)×10(B2～B11)孔加入上述配置好的培養液，100 μl/孔。

2.5 流式分選 先加100 μl/孔完全培養基于96孔板，用流式細胞分選儀(Influx，BD公司)分選標記好的細胞懸液，分選出表型為Sca1+c-kit+lin－CD34－的單個HSC接種于96孔板中，每孔1個細胞。

2.6 細胞培養 將分選接種好的HSC培養板置于孵箱中，37℃，5%CO2濃度，飽和濕度培養10 d，觀察細胞生長情況。

2.7 細胞涂片與流式分析 在產生了陽性集落的孔中，挑選細胞數大于20 000的孔，每個孔平均分為兩部分，其中一部分用甩片機甩片(5 min，500 r·min－1)，制成血細胞涂片;晾干24 h后，用瑞士－吉姆薩染液染色0.5 h，洗去染液。顯微鏡100×觀察，計數各系細胞比例(總共計數200個)。另一部分用:Percp-cy5.5-anti-GR-1，PE-anti-CD41，APC-cy7-anti-Mac-1，APC-anti-Ter119 抗體(各 0.5μl)混合液標記，流式檢測不同血細胞的比例。

Tab 1 Colony frequency

3 結果

3.1 細胞、集落形態記錄 培養10 d過程中對細胞進行觀察，并隨機選擇某孔進行拍照，記錄細胞、集落形態:從圖像記錄中可以看出，在3 d時，得到3～5個細胞，5 d時細胞數量達到幾十個，到10 d時，形成大約數萬個細胞組成的血細胞集落。見Fig 1。

3.2 集落形成頻率 在一般培養條件下，統計每塊96孔板中能夠生長出克隆的陽性孔數量，并統計陽性率(集落形成頻率)。

從Fig 1可以看出:每塊96孔板(n=5)所能得到的陽性孔占全部有效孔(10 d后仍含有足量培養液的孔數)的比例(Tab 1)穩定在0.75～0.9之間。SD值＜0.1，說明該實驗可以較好的重復。

Fig 1 The image of blood cell colony A:3 d;B:5 d;C:10 d

Tab 2 Proportion of cell type and proportion of surface marker expression

3.3 血細胞涂片結合流式細胞分析實驗結果 血細胞涂片鏡下觀察計數。可以看到視野中有:中性粒細胞——特征為環狀核、桿狀核、分葉核，大約占0.4～0.5的比例;巨核細胞——特征為體積約是中性粒細胞的5～10倍，并可見云霧狀血小板;未成熟細胞——特征為核偏于胞質一側，胞核、胞質著色深。

將血細胞涂片計數所得各系細胞比例，與流式檢測結果相對照，見Tab 2，表的左半部分是細胞涂片計數結果，右半部分是流式細胞分析表面標記的表達情況結果，兩種方法對分化情況的反映結果相近，說明可以采用機器分析代替人工計數。

3.4 陽性化合物實驗驗證 以下是培養10 d后，通過每組3次重復實驗的集落產生陽性率來確定藥物是否有促進造血集落生成的作用。陽性率:每組計數得到的血細胞集落數/該組接種單個造血干細胞孔數。從陽性率結果統計可以看出，化合物的作用明顯促進了單個HSCs形成造血集落的能力:相對空白對照組，加藥組生成了更多的造血集落［見Fig 2，20 μmol·L－1組與對照組差異有顯著性，P＜0.01(t檢驗，單尾，齊方差)］。實驗結果與前期體外、體內實驗結果相同——化合物促進了HSCs的增殖和產生造血集落的能力。

每板隨機抽取10孔進行流式分析，分化情況見Tab 3，表中列出部分結果。

Tab 3 Proportion of surface marker expression

Fig 2 Frequency of experimental and control group＊＊P＜0.01 vs Control

從流式分析結果中可以看出，實驗組與對照組之間無差異，加藥組也無明顯偏系分化，只是粒－單核系祖細胞(granulocyte mmacrophage progenitors，GMP)子代細胞與巨核－紅系祖細胞(megakaryocyte erythroid progenitors，MEP)子代細胞間的比例有波動。

綜合陽性率與流式分析實驗結果來看，細胞培養時所加化合物起到了促進了HSCs的增殖作用，不會造成惡性增殖或偏系分化，與文獻報道的該化合物對HSC的作用結果相同。該實驗說明單個HSC培養實驗在測定干細胞生長能力、分化能力時，能夠一定程度地客觀反映化合物對造血干細胞的作用，符合化合物篩選需求，可以應用于大規模的靶向HSC擴增的化合物篩選的需求。

4 討論

本實驗建立了一種體外穩定培養單個造血干細胞的實驗方法，使單次實驗陽性克隆生成率達到0.8以上，實現了可重復性強的效果。陽性率不能達1的原因主要有:①由于采用流式細胞儀進行細胞分選，雖然設定是每孔分選單個造血干細胞，但是由于機器分選可能存在的個別孔未加入細胞的情況;② 分選出的 Sca1+，c-kit+，Lin－，CD34－細胞目前認為屬于長周期造血干細胞(LT-HSC)，但文獻表明，僅有40%的LT-HSC可以分化產生全部nmEM(粒細胞、單核細胞、紅系細胞、巨核細胞)四系成熟細胞［7］。

另外，由于分選出的細胞所處細胞周期不同、細胞表面受體水平不同、接受信號刺激不同，導致細胞在生長分化過程中個體差異大，最終血細胞集落大小、分化情況差異明顯。

綜上，由于不可避免的系統誤差導致分選出的細胞個體差異顯著。可以采用更加精準的表面標記，篩選更純的、分化階段更原始的造血干細胞，如采用slam family marker系統等［9］。但是如果是進行化合物篩選實驗時，則無需選用slam family marker，而應做到高通量篩選和多次重復(即分選多塊96孔板)，并進行科學統計來降低系統誤差產生的影響。

本研究通過測定血細胞表面標記表達與血細胞涂片計數各系分化情況的結果相對比，可以得出兩組數據間具有正相關性，采用流式分析代替人工計數，從而達到更客觀、自動化水平更高的目的。

細胞涂片結果分析:由于培養時間較短，細胞分化水平比較低，不成熟細胞占據較大比例;分化的細胞基本都屬于髓系細胞。成熟細胞中主要以中性粒細胞為主，巨核細胞占少量;也就是說GMP及其子代細胞占多數，MEP及其子代細胞占少數。

流式分析細胞表面標記:① Gr-1抗原在髓系細胞中表達［10］，但是不會在淋系或紅系細胞中表達;在骨髓或外周血中，anti-Gr-1主要可以標記成熟粒細胞。GR-1還可能在單核細胞發育過程中一過性表達。因此從流式分析結果可以看出，標記有Gr-1的細胞占據絕大多數，即HSCs主要分化為粒－單系細胞。② Mac-1(CD11b)在自然殺傷細胞(NK細胞)、中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞中高表達。因此表達Mac-1的細胞占據90%以上也說明了HSCs主要分化為粒－單系細胞。③CD41是由巨核細胞表達的，作用是促進血小板黏附和凝集;有報道稱CD41也在造血祖細胞中表達。標記有CD41的細胞比例與巨核細胞加未成熟細胞總比例相近。結合以上3點:中性粒細胞表達Gr-1和Mac-1，巨核細胞主要表達CD41，未成熟細胞表達Gr-1、Mac-1和部分CD41。結合細胞涂片結果說明兩種實驗方法在反映細胞分化情況時結果吻合。

本研究使用一種可以促進HSCs擴增的化合物，通過陽性率鑒定，該化合物確實促進了HSCs的增殖，同時不會造成細胞偏系分化或過度增殖，與文獻報道的結果一致，說明該實驗方法在篩選促進HSCs擴增的化合物時具有很好的應用前景。

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