光損傷后Caspase-3在RPE的表達及EPO對其的影響

姜文靜，牛膺筠

(1.青島市海慈醫療集團眼科，山東 青島 266033;2.青島大學醫學院附屬醫院眼科，山東 青 島 266003)

眾所周知，適量的光線對視覺的形成是非常必要的。相反，如果光線的強度、光照的時間等超過了視網膜的承受力，那么將會造成視網膜的光損傷。光損傷后視網膜成分的丟失可能涉及凋亡，而Caspase-3是細胞凋亡的的必經之路。重組人促紅細胞生成素(rhEPO)可抑制光化學損傷誘導的人RPE細胞的凋亡，對人RPE細胞的光化學損傷有保護治療作用［1］。本課題建立光損傷模型，應用外源性EPO進行治療，觀察EPO與凋亡、Caspase-3的關系，探討EPO的保護作用，為其臨床應用治療視網膜光損傷類疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 52只♂BALB/c小鼠，體質量12～20 g，隨機分為對照組(4只)、單純光照組(24只)和EPO預處理組(24只)3組。后兩組按光照后處死時間的不同，分為6 h、12 h、36 h、72 h、96 h 和7 d 6 個亞組。

1.2 試劑 3 000 U/ml rhEPO(沈陽三生制藥公司)，caspase-3兔IgG多抗(武漢博士德公司)，PV6001二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法 將48只BALB/c小鼠放于6000LUX光照箱前，EPO預處理組和單純光照組小鼠分別腹腔注射rhEPO和等量生理鹽水，劑量為5 000 U·kg－1。光照箱由中國海洋大學光學研究室研制。分別于光照后6 h、12 h、36 h、72 h、96 h及7 d處死4只小鼠，摘除眼球，制作石蠟切片。同文獻［2］。應用光鏡HE染色法觀察各組小鼠視網膜色素上皮層形態學的改變，常規免疫組織化學方法檢測RPE中Caspase-3的表達變化。

1.4 統計學分析 采用SPSS10.0軟件進行統計學分析，數據用±s表示，兩組數據比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 HE染色結果 正常BALB/c小鼠視網膜結構層次分明，RPE細胞呈單層線狀排列，細胞形態規整。光照后各亞組隨時間推移分別出現RPE細胞水腫，排列疏松，邊界不清、形態不規則，后期出現核濃染、核破碎及丟失現象。EPO預處理組小鼠視網膜組織學改變較晚發生且不明顯，光照后7 d也未見細胞丟失現象。

2.2 Caspase-3的表達變化 正常組沒有檢測到棕黃色的陽性染色;單純光照后各亞組均可見到陽性表達細胞，且隨光照后時間的推移陽性表達呈現逐漸遞增的趨勢，光照后96 h，caspase-3陽性細胞數達到最高峰;光照后7 d，Caspase-3蛋白的表達又開始下降。EPO預處理組僅光照后96 h組和7 d組有少量陽性細胞表達。兩組同時間段相比較差別有統計學意義(P＜0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Time light-induced group EPO pretreatment group t P 6 h 18.88 ±3.14＊＊2.78 ±2.56 11.24 ＜0.01 12 h 24.83 ±4.53＊＊ 3.34 ±2.12 12.15 ＜0.01 36 h 44.92 ±3.64＊＊ 3.98 ±3.14 24.09 ＜0.01 72 h 92.26 ±4.67＊＊ 4.75 ±2.63 46.18 ＜0.01 96 h 297.28 ±2.23＊＊ 20.43 ±2.62＊＊ 227.59 ＜0.01 7 d 167.95 ±3.28＊＊ 15.78 ±3.96＊＊83.70 ＜0.01

3 討論

本研究視網膜光損傷后，RPE細胞結構發生了重要的病理改變，視網膜光損傷所導致的色素上皮細胞的凋亡與Caspase-3蛋白酶的激活有著密切的關系。我們將rhEPO作為一種預處理因素應用到光損傷模型中，觀察發現EPO可在一定程度上保護RPE功能，抑制細胞凋亡，從而對視網膜光損傷起到治療作用。這與相關文獻報道一致［3－6］。

綜上所述，本實驗結果證實了Caspase-3誘導視網膜光損傷后的色素上皮細胞凋亡，同時觀察發現EPO可抑制Caspase-3蛋白的表達，減少色素上皮細胞的凋亡，推測這可能是EPO治療視網膜光損傷的作用機制之一，從而為包括視網膜光損傷疾病在內的多種視網膜變性疾病的研究開辟了新的治療手段。

［1］孟 巖，牛膺筠，周占宇，等.rhEPO對光損傷誘導的RPE細胞凋亡的抑制［J］.中國藥理學通報，2007，23(10):1275－9.

［1］Meng Y，Niu Y J，Zhou Z Y，et al.Inhibition of light induced apoptosis of RPE cells by recombinant human erythropoietin［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1275－9.

［2］王紅云，牛膺筠，王培嵩，等.重組人促紅細胞生成素對小鼠視網膜光損傷保護作用的研究［J］.中華眼科雜志，2005，41:434－8.

［2］Wang H Y，Niu Y J，Wang P S，et al.Erythropoietin administration protects retina against light-induced retinal degeneration［J］.Chin J Ophthalmol，2005，41(10):434－ 8 .

［3］Kawano T，Kato M.Electrophysiologic evaluation of retinal pigment epithelial damage induced by photic exposure［J］.Retina，2003，23(4):513－7.

［4］Becerra S P，Amaral J.Erythropoietin-an endogenous retinal survial factor［J］.N Engl Med，2002，347(24):1968－70.

［5］Nishiya D，Omura T，Shimada K.Effects of erythropoietin on cardiac remodeling after myocardial infarction［J］.J Pharmacol Sci，2006，101(1):31－9.

［6］Sepodes B，Maio R，Pinto R.Recombinant human erythropoietin protects the liver from hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat［J］.Transpl Int，2006，19(11):919－26.