新藤黃酸誘導HepG2細胞凋亡與Bax及Bcl-2的關系

劉衛海，肖國麗，賴小平，趙愛國，2，3

(1.廣州中醫藥大學新藥開發研究中心，廣東廣州 510006;2.清遠醫藥集團，廣東清遠 511518;3.東莞廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院，廣東東莞 523808)

中藥藤黃(gamboge)系藤黃科植物藤黃樹(Garcinia hanburyiHook.F.G)所分泌的干燥樹脂，近年來，藤黃的抗腫瘤作用受到高度關注。已有研究證實，新藤黃酸(neo-gambogic acid，NGA)為藤黃抗腫瘤作用的主要有效成分之一［1－3］。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一［4］，同時也是第三大引起患者死亡的腫瘤［5］。為此，本實驗探討了新藤黃酸誘導肝細胞癌HepG2細胞凋亡的作用機制，旨在為進一步開發新藤黃酸提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗藥物與細胞株 新藤黃酸(NGA):亮黃色粉末，由廣州中醫藥大學新藥開發研究中心制備，純度95.83%，批號20100304;人肝細胞癌HepG2細胞株:購自中國科學院細胞庫，本實驗室傳代保存。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis kit雙染試劑盒、Cell cycle strain solution細胞周期檢測試劑盒(聯科生物公司)。

1.3 主要儀器 CO-150型二氧化碳培養箱(美國NBS公司);CKX-41-32型倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司);FC500型流式細胞儀(美國貝克曼－庫爾特公司，配有CXP2.0分析系統)。

2 方法

2.1 細胞培養及給藥［6］人肝細胞癌HepG2細胞株培養于體積分數為0.10的胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱內，每24 h～48 h換液1次，常規消化傳代，取對數生長期細胞進行各項實驗。NGA溶于二甲基亞砜(DMSO)，給藥時用生理鹽水稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度小于0.001(體積分數);對照組給相應體積的溶媒，DMSO的終濃度為0.001(體積分數)。

2.2 流式細胞術檢測細胞早期凋亡率及細胞周期 分別按AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis kit試劑盒說明書和Cell cycle strain solution細胞周期檢測試劑盒說明書操作。

2.3 Western blot法檢測Bax和Bcl-2的表達水平 Western blot實驗參照《精編分子生物學實驗指南》［7］進行。顯影，定影，拍照后，用NIH Image J軟件對照片進行灰度分析，Bax蛋白和Bcl-2蛋白的含量用目的條帶灰度值與內參βactin條帶灰度值的比值表示。

2.4 統計學分析 運用SPSS11.5軟件包對數據進行統計處理，多組均數間比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用兩獨立樣本t檢驗分析。

3 結果

3.1 NGA對HepG2細胞的早期凋亡率的影響 在流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限顯示早期凋亡細胞，右上象限顯示晚期凋亡及壞死細胞。NGA(2.0 mg·L－1)給藥后12 h～36 h，給藥組出現明顯的早期凋亡現象，給藥后48 h，大部分早期凋亡細胞轉變成晚期凋亡及壞死細胞(Tab 1)。

3.2 NGA對 HepG2細胞周期的影響 NGA(2.0 mg·L－1)給藥后12 h～36 h，S期細胞明顯增多，給藥后 48 h，G0/G1期細胞明顯增多(Tab 2)。

3.3 NGA對HepG2細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響經NGA作用后，HepG2細胞的Bax蛋白表達隨NGA濃度增大逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達逐漸減少，Bax/Bcl-2比值升高(Tab 3)。

Tab 1 Effect of NGA on early apoptotic rate in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 1 Effect of NGA on early apoptotic rate in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Treated time/h Apoptotic plus necrotic cell/%Early apoptotic cell/%12(control)0.09 ±0.07 2.50 ±0.88 12(treated) 0.86 ±0.29* 32.19 ±2.08*24(control) 0.12 ±0.04 4.16 ±1.21 24(treated) 2.25 ±0.23* 49.44 ±3.12*36(control) 0.22 ±0.13 5.12 ±1.93 36(treated) 31.66 ±4.25* 36.90 ±2.15*48(control) 4.49 ±1.12 14.96 ±2.13 48(treated) 70.85 ±5.02*9.90 ±1.01

Tab 2 Effect of NGA on cell cycle kinetics in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 2 Effect of NGA on cell cycle kinetics in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Treated time/h Cell population in different phases/%G0/G1 S G2/M 12(control)77.949 ±4.711 7.285 ±1.048 14.766 ±2.663 12(treated) 69.074 ±7.221 21.094 ±5.036* 9.832 ±1.945*24(control) 71.767 ±8.625 6.893 ±1.946 21.340 ±5.266 24(treated) 70.733 ±6.256 25.447 ±3.371* 3.819 ±0.856*36(control) 71.283 ±9.172 8.542 ±2.863 20.175 ±2.817 36(treated) 71.585 ±8.662 24.426 ±3.225* 3.989 ±1.035*48(control) 64.165 ±5.261 8.667 ±2.359 27.168 ±6.387 48(treated) 83.743 ±6.898*8.464 ±2.083 7.793 ±2.651*

Tab 3 Effect of NGA on the expressionof Bax and Bcl-2 in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 3 Effect of NGA on the expressionof Bax and Bcl-2 in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Concentration/mg·L－1 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 value Control － 0.099 ±0.029 1.654 ±0.147 0.06 NGA 1.0 0.252 ±0.190* 0.871 ±0.237* 0.29*2.0 0.786 ±0.218* 0.349 ±0.199* 2.25＊＊3.0 1.035 ±0.289＊＊ 0.049 ±0.026＊＊ 21.14＊＊

4 討論

近年來的研究證明，很多抗腫瘤藥物均可引起腫瘤細胞的凋亡，從而達到抗腫瘤療效，細胞凋亡也已被用來作為評價抗腫瘤藥物療效的指標之一。本實驗結果顯示，在一定時間范圍(給藥后12 h～36 h)，給藥組的早期凋亡率均明顯高于對照組的早期凋亡率，據此可推斷在一定時間范圍NGA具有誘導細胞凋亡的作用。

細胞周期阻滯與細胞凋亡密切相關，本實驗結果顯示，NGA在給藥后12 h～36 h，主要使細胞阻滯在S期(即DNA合成期)，其原因可能是NGA影響細胞DNA的合成及復制，引起DNA損傷，使細胞未能通過DNA損傷檢測點［8］。這有別于大多數抗腫瘤藥物將細胞阻滯在G1期［9］，其原因有待進一步研究。

普遍認為Bax和Bcl-2兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素之一［10］。在細胞中，當Bax表達量較高時，形成同源二聚體Bax/Bax，促進細胞凋亡，當Bcl-2表達量較高時，形成異源二聚體Bcl-2/Bax，抑制細胞凋亡［11］。本實驗結果顯示，經NGA作用后，HepG2細胞的Bax蛋白表達隨NGA濃度增大逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達逐漸減少，Bax/Bcl-2比值升高，Bax表達占主導，從而使細胞對凋亡信號的反應增強，誘導細胞凋亡。

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