β-抑制蛋白在AT1受體信號通路中的作用及意義

魏 凱，徐添穎，管云楓，繆朝玉

(第二軍醫大學藥學院藥理學教研室，上海 200433)

血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素－血管緊張素系統的最重要的活性物質。AngⅡ通過與其主要受體血管緊張素Ⅱ一型受體(angiotensinⅡ t ype 1 receptor，AT1受體)結合，在病理生理條件下，形成廣泛的信號網絡，參與心血管活動的調節，如血管收縮、血管與心肌重構等。作為心血管系統最重要的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)之一，AT1受體接受AngⅡ刺激后，能與多種G蛋白偶聯，如Gq/11、G12/13、Gi蛋白，并激活下游的磷脂酶C、A2 和 D［1］，傳 統 認 為 G q/11-PLC-IP3/DAG-Ca2+/PKC 通 路(Fig 1)是細胞內AT1受體下游信號網絡形成的基礎。AngⅡ還可激活胞內多條激酶系統［2］，如促分裂原活化蛋白激酶通路(mitogenic activated protein kinase pathway，MAPK 通路)，包括細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)和p38MAPK;以及受體與非受體酪氨酸激酶通路，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Src激酶家族成員等。AngⅡ還可激活多種小分子量GTP結合蛋白，如Ras、Rho和Rab家族部分成員。

β-抑制蛋白(β-arrestins，βArrs)屬于Arrsestin家族，Arrsestin家族包括 a rrestin1、arrestin2(βArr1)、arrestin3(βArr2)和arrestin4，其中βArr1和βArr2廣泛表達。以往認為βArrs主要參與GPCRs的脫敏、內化等負反饋調節，最近研究表明，βArrs還可作為支架蛋白，參與GPCRs的非G蛋白信號的形成。βArrs對AT1受體的調節也涉及上述兩個方面，目前AT1受體下游信號網絡分為Gq/11依賴的和非Gq/11依賴(βArrs依賴)的兩條通路。內源性配體AngⅡ可同時激活Gq/11依賴和 βArrs依賴的兩條信號通路，沒有選擇性，是AT1受體的完全激動劑。而某些外源性配體如SⅡ(AngⅡ的1、4、8位三取代衍生物)可選擇性激活 βArrs依賴的通路，是AT1受體的偏向性激動劑［3］。多項基于細胞的蛋白－蛋白相互作用組學和蛋白磷酸化組學的研究分析了AngⅡ和SⅡ誘導的AT1受體下游的信號網絡，結果表明多達337種胞內蛋白與βArr1或βArr2相互作用［4］;224個蛋白的磷酸化水平受到SⅡ的調節［5］;1183個磷酸化位點受到AngⅡ或SⅡ的調節［6］。可見，βArrs廣泛參與AT1受體下游信號通路的調節。基于此，本文將綜述βArrs對AT1受體信號通路的調節及其意義。

Fig 1 β-arrestins mediated endocytosis of AT1receptor

1 βArrs對AT1受體的調節

1.1 AT1受體脫敏和內化 AngⅡ刺激AT1受體后，βArrs向AT1受體轉位，阻遏 AT1受體與 Gq/11的偶聯，即阻斷Gq/11信號轉導，導致受體快速脫敏。同時AT1受體的內化降低了胞膜表面受體數量，導致細胞進一步脫敏。

βArrs介導的AT1受體內化過程已研究得比較清楚［7］，即是指AT1受體-βArrs復合物經衣被小泡(clathrin-coated vesicles)介導的內吞(Fig 1)、胞內轉運、定位分選以及降解過程。有幾類蛋白參與了這一過程，包括G蛋白偶聯受體激酶(GRKs)、轉運蛋白(發動蛋白dynamin、籠形蛋白clathrin和銜接蛋白AP2)、小G蛋白(Rab家族和ARF6)和泛素化蛋白。

1.2 βArr1和 βArr2 AT1受體與 βArr1和 βArr2具有相同的高親和力，但βArr1和βArr2對AT1受體的調節作用并不完全一致。例如，βArr1和βArr2均能參與AT1受體的內化過程［8］，而AngⅡ誘導ERK1/2的激活是βArr2依賴的，與βArr1無關。這可能與AT1受體-βArrs復合物的穩定性和βArrs部分結構域的差異有關［9］。

Fig 2 β-arrestins and Gα protein dependent signaling pathways of AT1receptor

2 βArrs與AT1受體的信號通路

除了具有介導GPCRs的內化、阻遏Gα蛋白與GPCRs偶聯的經典功能，得益于自身的多個蛋白結合位點，βArrs還可作為支架蛋白，與多種信號分子直接結合，開啟不依賴Gα蛋白的信號通路［10］。AT1受體-βArrs復合物內吞到胞質后，βArrs可與各種蛋白結合，形成“信號體(signalsome)”(Fig 1)，參與下游的信號轉導或調節細胞內活動。

2.1 MAPK通路 MAPK家族廣泛參與AT1受體的介導的多種細胞反應，如增殖、肥大等。MAPK家族包括ERK1/2、JNKs和p38MAPK，目前僅有證據表明βArrs參與AT1受體下游ERK1/2、JNKs兩條通路的調節(Fig 2)。

2.1.1 ERK1/2通路 ERK1/2是AT1受體下游信號網絡中研究得最多的MARK家族成員。刺激AT1受體可經過不同的途徑激活ERK1/2，包括已經闡明的Gq/11依賴的PKC/Raf-1/ERK1/2 和 βArr2 依 賴 的 AT1受 體-βArrs/Raf-1/ERK1/2兩條通路，另外c-Src或(和)EGFR“轉激活”依賴的Ras/Raf-1/ERK1/2通路似乎在Gq/11依賴和βArr2依賴的兩條通路中起到銜接作用。

Lefkowitz等［11］最早發現，AngⅡ刺激HEK293細胞，內吞的AT1受體-βArr2復合物可以募集Raf-1、MEK和ERK1/2，形成信號體并激活ERK1/2。Turner等［12］發現AngⅡ刺激內化突變失活的AT1受體仍能激活ERK1/2，同時PKC抑制劑可部分(≈50%)阻斷AngⅡ誘導的野生型AT1受體下游ERK1/2的磷酸化水平。Wei等［3］發現SⅡ只能部分激活ERK1/2活性，AngⅡ刺激Gq/11偶聯突變失活的AT1受體同樣只能誘導部分ERK1/2活性(≈50%);同時PKC抑制劑也只能部分取消AngⅡ誘導的野生型AT1受體下游ERK1/2的活性(≈60%)。可見，ERK1/2可由Gq/11依賴和βArr2依賴的兩條通路激活，但ERK1/2的激活在時間空間定位上卻不同，這預示著兩種不同的激活方式可能介導細胞對相同刺激的不同反應。研究證實［13］，Gq/11/PKC可迅速激活ERK1/2，同時較快失活(半衰期≈2 min)，激活的ERK1/2可以向核轉位，并激活核內底物，如 Elk-1;而βArr2依賴ERK1/2活性在5～10 min時達到峰值，ERK1/2活性可持續長達90 min，但激活的ERK1/2局限于信號體周圍，沒有核轉錄活性。目前，βArr1參與調控ERK1/2活性的作用的結論尚不統一［14］。

AT1受體下游的ERK1/2活性還可經EGFR/Ras或c-Src/Ras途徑激活。AngⅡ刺激AT1受體后可轉激活EGFR，然后募集 Shc、Grb2和 Sos，進而激活 Ras/ERK1/2級聯反應，而EGFR的轉激活過程又是 c-Src依賴的［1］。Shah等［15］和Turner等［12］分別發現，內化突變失活的AT1受體或者受體內吞受抑制后，AngⅡ仍能激活ERK1/2，而EGFR特異性抑制劑可以阻斷ERK1/2激活。有趣的是，Seta等［16］發現，－COOH端缺失的AT1受體阻斷了c-Src/Ras/ERK1/2通路;而Gq/11偶聯突變失活的AT1受體則保存AngⅡ誘導的c-Src激活，但c-Src/Ras激活的ERK1/2沒有核轉位活性。由此看來，EGFR/Ras/ERK1/2似乎是βArrs非依賴的途徑，而c-Src/Ras/ERK1/2則是 Gq/11非依賴的。事實上，Kim等［17］進一步證實了βArrs非依賴和Gq/11非依賴的ERK1/2激活途徑最終都匯聚到了c-Src/EGFR通路上。

AT1受體下游的Gq/11依賴的ERK1/2和βArrs依賴的ERK1/2通路在原代培養的血管平滑肌細胞［17］和心肌細胞［18］以及離體心臟灌流模型［19］上均已得到證實。

2.1.2 JNKs通路 AngⅡ激活JNKs需要多種Gα 蛋白依賴的胞內激酶參與，包括Rho家族的RhoA和Rac，Pyk-2和α-PAK［2］。βArrs作為支架蛋白可與 ASK1和JNK形成復合物，參與JNK的激活。McDonald等［20］發現 AngⅡ刺激過表達βArr2的COS-1細胞導致JNK3激活，但激活的JNK3活性僅局限于胞質，不能向核內轉位，免疫印跡檢測βArr2的共沉淀蛋白可檢出 ASK1，MKK4和 JNK3。與 βArrs依賴的ERK1/2激活一樣，AngⅡ誘導的JNK3激活的是βArr2依賴的，但其意義尚不明確。

2.2 酪氨酸激酶通路 Gβγ蛋白和活性氧簇可能參與AngⅡ誘導的c-Src激活，具體機制并不清楚［2］。EGFR可被包括AT1受體在內的的多種GPCRs轉激活，AngⅡ誘導EGFR轉激活需要多個信號分子參與，如Ca2+、c-Src、HB-EGF和ADAM17 等［1］(Fig 2)。

Fessart等［21］發現，AngⅡ刺激血管平滑肌細胞可誘導βArr2、c-Src和AP2形成復合物，參與AT1受體內化過程。研究［22］發現SⅡ的誘導的ERK1/2活性可被EGFR抑制劑完全阻斷，說明βArrs可能參與SⅡ誘導EGFR的轉激活。Kim等［17］認為，c-Src可被 βArr2募集并激活，進而磷酸化EGFR特異位點，介導AngⅡ誘導的EGFR轉激活。βArrs參與AT1受體下游的酪氨酸激酶通路調節的具體機制尚需進一步明確。

2.3 Rho/ROCK通路 Rho/ROCK通路廣泛參與調節AT1受體介導細胞收縮、遷移與細胞骨架重構，胞內Rho的活性受三類調節蛋白共同維持，分別是GTP酶激活蛋白、鳥苷酸交換因子和鳥苷酸解離抑制劑(GAPs、GEFs和GDIs)。AngⅡ可激活AT1受體下游G12/13依賴或Gq/11/PKC依賴的RhoGEFs，繼而激活 Rho/ROCK 通路［1］(Fig 2)。

最新研究表明，βArrs可能參與激活Rho/ROCK通路。AngⅡ刺激轉染了AT1受體的HEK293細胞后，RhoA迅速激活并在1min內達到最大值，而siRNA干擾βArr1則明顯降低RhoA活性［23］。另有研究［24］證明 βArr2特異的 siRNA預處理轉染AT1受體的HEK293細胞，AngⅡ刺激產生胞膜起泡的細胞數量明顯降低，而這一現象由Rho/ROCK/MLCK通路介導。

2.4 其他信號通路 機械應力刺激也能產生偏向性信號轉導。Rakesh等［25］發現，機械應力刺激后，誘導產生的βArrs構象變化與SⅡ刺激產生的相同，缺失βArrs或AT1受體的小鼠心臟對機械應力刺激不產生βArrs依賴的信號，如EGFR轉激活、ERK1/2和Akt的激活。

3 βArrs與AT1受體介導的病理生理

3.1 細胞收縮 作為腎素－血管緊張素系統的主要活性物質，AngⅡ首要作用就是收縮血管，且具有對心臟的正性肌力作用。AngⅡ刺激AT1受體，活化細胞內鈣離子，激活PKC，繼而收縮細胞(心肌和血管平滑肌細胞)。

Rajagopal等［26］報道了βArr2可參與心肌細胞收縮的調節，他們證實了SⅡ與AngⅡ可增強離體培養心肌細胞的縮短分數;PKC抑制劑降低AngⅡ作用的70%，不改變SⅡ的作用;敲除βArr2則取消SⅡ的作用，不改變AngⅡ的作用。說明βArr2可部分參與AngⅡ對心肌細胞正收縮性的調節。同樣的實驗方法證明后來發現的AT1受體的βArrs偏向激動劑 TRVs(TRV120027，120026，120023，AngⅡ 衍生多肽)［27］和曲格列酮［28］也具有正性肌力作用。但 Aplin 等［19］在離體心臟灌流模型上并未發現SⅡ的正性肌力作用。這可能與SⅡ的低親和力以及細胞與離體器官不同水平的實驗差異有關。目前βArrs介導的AngⅡ對心臟的正性肌力作用具體機制仍不清楚。

我們在離體血管張力實驗中發現，βArr1或βArr2敲除小鼠的離體胸主動脈對AngⅡ或新福林誘導的血管收縮反應與野生型小鼠相比無明顯差別(結果未發表)。而Hennenberg等［29］發現四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠的胸主動脈對AngⅡ的反應性降低。說明βArrs可能參與病理條件下AngⅡ對血管張力的調節。

3.2 增殖、肥大與凋亡抑制 AngⅡ在可誘導刺激平滑肌細胞和心肌細胞(新生鼠)增殖與肥大［30］，其效應主要由AT1受體下游的MARK通路介導。AngⅡ誘導的ERK1/2不同激活模式可能分別參與其肥大和增殖效應。Aplin等［18］在原代培養的新生鼠心肌細胞上證實，SⅡ刺激DNA合成和細胞膜數量增加的能力與AngⅡ相同;但SⅡ不能刺激細胞肥大性增長;表現為SⅡ缺乏AngⅡ誘導的核內Elk-1磷酸化以及誘導 c-fos和 ANP轉錄的能力，但可調節胞質底物p90RSK磷酸化。Kim等［17］進一步證明，干擾βArr2表達可取消SⅡ和AngⅡ刺激平滑肌細胞合成DNA的能力。可見，AngⅡ誘導的細胞的增殖效應主要是βArr2依賴的ERK1/2激活介導的，ERK1/2磷酸化胞質底物p90RSK可能與增殖效應有關。最近Smith等［31］和Ohtsu等［32］分別報道了 AngⅡ刺激心肌細胞和血管平滑肌細胞肥大的信號轉導通路，他們一致認為依賴Gq/11轉激活 EGFR的途徑活化下游ERK1/2，是刺激細胞產生肥大效應的主要途徑，βArrs不參與該過程。

βArrs可抑制多種 GPCRs誘導的細胞凋亡［33］，βArr1/2全敲除比野生型的MEFs對GPCRs介導的細胞凋亡數更多。Ahn等［34］證實AngⅡ或SⅡ預處理 VSMCs或 HEK293細胞可減少H2O2或依托泊苷誘導的細胞凋亡，siRNA干擾βArr2則取消 AngⅡ的抗凋亡作用。此外，AngⅡ誘導的胞質ERK1/2活性可磷酸化胞質底物Mnk1，參與蛋白質合成過程［35］，這一過程是 βArr2 依賴的。

3.3 體液調節 AngⅡ可刺激醛固酮產生，參與水鹽平衡的調節;AngⅡ還能直接刺激大腦中樞，調節鹽和水的攝取量。Lymperopoulos等［36］研究表明，βArr1參與AngⅡ刺激產生醛固酮過程，體外SⅡ刺激可上調醛固酮合成限速酶，產生并分泌醛固酮;體內過表達βArr1增加循環醛固酮水平。Daniels等［37］通過第三腦室注射 SⅡ、AngⅡ、SⅡ +AngⅡ發現，SⅡ比AngⅡ刺激攝取更多NaCl，SⅡ不增加反而拮抗AngⅡ對水的攝取。可見，AngⅡ對大鼠的水鹽平衡調節上也存在Gq/11和βArrs依賴的兩條途徑。

3.4 其他 βArrs還參與了的AngⅡ其他作用，如AngⅡ介導的趨化性［38］、應力纖維的形成［23］以及質膜起泡［24］等過程。

4 展望

AngⅡ誘導的AT1受體下游的復雜信號轉導通路是AngⅡ多樣化的病理生理作用的基礎，βArrs的參與使得AT1受體下游的信號網絡分為Gq/11依賴和βArrs依賴的兩條不同的通路。兩條信號通路獨立介導或協同參與AngⅡ誘導的不同細胞反應，進一步闡明了AngⅡ多種生理病理效應的分子機制。但是，細胞水平的信號通路研究還需要整體動物實驗數據的支持，利用基因敲除小鼠和偏向激動劑作為研究手段，將進一步確認βArrs在AngⅡ調節心血管活動中的意義。

偏向激動劑的出現不僅作為一種研究手段促進了βArrs的功能研究，也為新藥研發開辟了思路。臨床廣泛使用的降壓藥血管緊張受體阻斷劑可拮抗AngⅡ的縮血管作用，從而降低血壓。但這種拮抗作用可能同時阻斷了AngⅡ的其他有利效應，如抗凋亡等細胞保護以及心肌的正性肌力作用。偏向激動劑的優勢在于不僅可以阻斷AT1受體下游Gq/11依賴性信號通路的不利作用，還激活AT1受體的βArrs依賴的有益信號通路，推測對充血性心衰、缺血/再灌注心肌損傷可能有更好的治療作用。最新研究報道，TRV120027作為一種新型的偏向激動劑，正在開展二期臨床實驗，用于治療心衰患者。當然，并不是所有βArrs依賴的作用都是有益的，例如βArr1介導了AngⅡ刺激醛固酮分泌這一過程［36］。因此，更深入的研究對于進一步闡明βArrs參與AngⅡ對心血管活動的調節作用是非常有必要的。

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